外泌体DNA分离试剂盒
保存与应用
【保存条件】
本试剂盒低温下运输,室温或 2-8℃下保存至少一年(按照试剂盒不同成分分别 保存),使用前请详细阅读说明书。
【应用范围】
本产品只用于科学研究,不能用于临床诊断。
产品介绍
外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-200nm 的胞外膜性囊泡 (extracellular vesicle, EVs)。外泌体普遍存在于多种体液中,其内容物丰富,包 括蛋白质、脂质、核酸等,在细胞间信息交流中发挥着重要作用,主要参与免疫 抗原呈递,神经递质传递,脂类代谢,及细胞信号转导等过程,并与多种疾病的 发生、发展、治疗及预后密切相关。
近年来,液体活检作为一种新的非侵入式主要检测血液中循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)和循环肿瘤 DNA(Circulating Tumor DNA, ctDNA),获取患者肿瘤病变信息,用以辅助诊断、治疗,研究表明,在外泌体 中已检测到基因组 DNA 和线粒体 DNA (Thakur BK et al.2014; Akiko Takahashi,et al.2017; Kalhert et al.2014),为了帮助研究人员对外泌体 DNA 的研究和应用,我 们研制了外泌体 DNA 分离试剂盒(Exosome DNA Isolation Kit),适用于从细胞 培养上清或体液(血清/血浆等)中分离得到的外泌体,采用优化的裂解液提取 分离的外泌体中 DNA,这里外泌体分离方法可以包括超速离心、化学沉淀、免 疫捕获和分子大小排阻等,接下来采用核酸特异吸附柱(Spin Columns),可方 便、快捷地纯化和洗脱外泌体 DNA,可直接用于下游应用,如 realtime PCR,基 因突变检测,NGS 测序和 microarray 等。
试剂盒组成和说明
使用前先在每瓶洗涤液 A (Wash Solution A)中加入 45ml 无水乙醇,混匀,并在瓶标签上标 记“√”,每次使用后立即盖紧瓶盖。
【注意事项】
1. 各产品组分根据要求在合适的温度下保存,自购买之日起有效期至少一年。 试剂盒在使用前先恢复室温,裂解液 D 在使用前检查是否有盐沉淀,建议在 使用前 37℃水浴 10 分钟,混合均匀,无沉淀,溶液清澈。
2. 本试剂盒所有离心均在室温下进行。
3. 需要自备试剂:预冷的无水乙醇。
操作方法
1. 外泌体 DNA 释放
取 200μl 分离的外泌体溶液,加入 10μl 蛋白酶 K 溶液,混匀,56℃孵育 10min, 恢复室温。加入 200μl 裂解液 D,涡旋振荡 15sec,室温放置 5min。加入 400μl 预冷的无水乙醇,充分颠倒混匀(此时可能产生白色絮状沉淀)后室温放置 5min。
注意:裂解液 D 在使用前应恢复室温,为了提高提取效率建议裂解液 D 使用前 37℃水浴 10 分钟后使用。
2. 外泌体DNA结合
将上一步所得溶液和沉淀分两次加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中,每次 上柱体积不得大于 700μl),室温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,倒掉收集管中 的滤液,将吸附柱放入收集管中。打开吸附柱盖子,于室温放置 5-10min,以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤液。
注意:这一步的目的是将吸附柱中的残余的洗涤液去除,洗涤液中的乙醇的残留会影响后续 的酶反应(酶切、PCR 等)实验。
3. 外泌体 DNA 洗涤
向吸附柱加入 500μl 洗涤液 A(请检查是否已加入指定量的无水乙醇),室 温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入收集管 中,重复洗涤 1 次。将吸附柱放入收集管中 12,000×g 再离心 2min,去除残液。
4. 外泌体洗涤
将吸附柱转入新的 1.5ml 离心管中(试剂盒提供),向吸附柱中间位置悬空 滴加 50-200μl 洗脱液 A,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,离心得到的溶液 再加入吸附柱中,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,最后离心管中液体为提 取的外泌体 DNA,可直接应用于下游实验或保存在-80℃。 注意:洗脱液体积不应小于 50μl,体积过小会影响回收效率。洗脱液的 pH 对于洗脱效率有 很大影响,若用水做洗脱液应保证 pH 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率。
用途:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。