蔗糖磷酸合成酶(SPS)测试盒
正式测定管前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
蔗糖不仅是重要的光合产物,也是植物体内运输的主要物质,还是碳水化合物的贮存形式之一。SPS(EC 2.4.1.14)以果糖-6-磷酸为受体,形成的蔗糖磷酸在蔗糖磷酸酶的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径。
测定原理
蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸与间苯二酚反应可呈现颜色变化,在 480nm 下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。
需自备的的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰
试剂的组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 2.5mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:1000μg/mL 蔗糖溶液 10mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:液体 2mL×1 瓶,4℃保存
试剂四:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;
试剂五:液体 6mL×1 瓶,4℃保存;
样品测定的准备:
按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 480nm,蒸馏水调零。
2、样本测定,(在 EP 管中依次加入下列试剂):
混匀,沸水浴 30min,冷却后,取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中,480nm 下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。
SPS 活力单位的计算
1、按照蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SPS 活性(μg /min/mg prot)= C 标准管×V1×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按照样本鲜重计算
单位定义:每 g 组织每分钟催化产生 1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位。
SPS 活性(μg /min/g 鲜重) = C 标准管×V1×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷WC 标准管:标准管浓度,1000μg/mL;V1:加入反应体系中样本体积,0.01mL; V2:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;T :反应时间:10min。