一、自噬简介
自噬（autophagy=self-eating）意为自体吞噬，是真核细胞在自噬相关基因（autophagy related gene，Atg）的调控下利用溶酶体降解自身细胞质蛋白和受损细胞器的过程。自噬可防止细胞损伤，促进细胞在营养缺乏的情况下存活，并对细胞毒性刺激作出反应。自噬包括生理条件下的基础型自噬和应激条件下的诱导型自噬。前者是细胞的自我保护机制，有益于细胞的生长发育，保护细胞防止代谢应激和氧化损伤，对维持细胞内稳态以及细胞产物的合成、降解和循环再利用具有重要作用；但自噬过度可能导致代谢应激、降解细胞成分，甚至引起细胞死亡等。研究表明，自噬能在细胞稳态、衰老、免疫、肿瘤发生及神经退行性疾病等多种生理病理过程中发挥重要作用。

2.自噬的分类

根据细胞物质通向溶酶体途径的不同，自噬一般分为三类：巨自噬 (macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)。

巨自噬其特征是双层膜结构“自噬体”的形成，自噬体包裹胞质成分，如蛋白质聚集体、损伤或衰老的线粒体、过氧化物酶体等，最终与溶酶体融合。

微自噬则是溶酶体直接内陷成囊泡，包裹部分胞质进入溶酶体，没有独立的双层膜自噬体形成。

分子伴侣介导的自噬则不依赖囊泡结构，直接借助伴侣蛋白Hsc70，特异性地降解带有独特识别五肽基序（KFERQ样）的靶蛋白，溶酶体膜上的受体蛋白LAMP2A识别结合蛋白暴露的KFERQ基团，引导靶蛋白进入溶酶体降解，具有高度选择性。

当然，部分巨自噬和微自噬也会对“货物”有选择性，比如Cvt途径、过氧化物酶体自噬和线粒体自噬、内质网自噬等。这些选择性自噬的主要过程与非选择性自噬基本类似，但选择性自噬有自己特异的受体蛋白介导特定的包含物配体，即有识别底物的过程。

图2

此外，据细胞所处环境及自噬发生的程度不同，细胞自噬还可分为基础自噬和诱导自噬。基础自噬是一种在大多数细胞中持续发生而水平相对较低的细胞自噬过程，对细胞内物质的更新及内稳态的维持具有不可或缺作用；诱导自噬则属于一种应激状态，其发生程度明显强烈，在细胞应对外界恶劣环境、维持生存中发挥重要功能。

三、自噬的过程

巨自噬作为经典的细胞自噬，也是过程最复杂的一种自噬。其发现最早，机制研究最清晰，因此也被狭义的等同为细胞自噬，下文中的自噬不作特别说明即为巨自噬。其发生可分为以下几个阶段：

1)自噬诱导阶段（Induction）：主要通过ATG1/ULK1复合体(包括ATG1/ULK1、ATG13、FIP200和ATG101)来介导。在营养丰富的条件下，雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)与ATG1/ULK1复合物结合，会磷酸化ATG1/ULK1和ATG13，导致它们失活，抑制自噬发生。当缺乏营养或用雷帕霉素（Rapamycin，mTORC1复合物抑制剂）处理时，mTORC1从复合物中解离，ATG1/ULK1和ATG13磷酸化水平降低，ATG1/ULK1复合物形成，自噬启动。（注：ATG1即Yoshinori Ohsumi发现并命名的第一个酵母自噬相关基因，ULK1是哺乳动物中ATG1的同源蛋白。）

2)前体成核阶段（Nucleation）：主要由Vps34-Beclin 1复合体介导，该复合物由Vps34（PIK3C3）、Beclin 1（ATG6）、Vps15（PIK3R4或p150）和ATG14组成，可生成Ptdins3P，招募其他效应蛋白，介导吞噬泡成核；还可召集ATG12-ATG5-ATG16复合物以及LC3，并通过后两者促进吞噬泡膜的延伸。

3)延伸阶段（Elongation）：自噬前体形成之后，吞噬泡膜会继续延伸，直至完全包裹内容物。在此过程中，两个泛素样蛋白(UBL)修饰系统发挥关键作用。

第一个是ATG5-ATG12复合体。ATG12作为类泛素蛋白，在ATG7（类E1泛素活化酶）和ATG10（类E2泛素转移酶）的作用下，结合ATG5，生成ATG12-ATG5复合物。随后该复合物又与ATG16结合形成ATG12-ATG5-ATG16复合物，该复合物具有类E3泛素连接酶活性。

第二个是ATG8/LC3系统。ATG8（LC3）作为泛素样蛋白，首先被半胱氨酸蛋白酶ATG4切割成胞浆可溶性的LC3-I，然后被ATG7（类E1酶）激活处理，在ATG3（类E2酶）和ATG12-ATG5-ATG16复合物的作用下，最后与脂质磷脂酰乙醇胺(PE)共价结合，形成脂溶性的LC3-PE(LC3-II)，参与自噬体的延伸。

4)自噬体成熟阶段：随着自噬体的扩张和封闭，自噬体经历成熟过程，包括逐渐清除在自噬体外膜上的ATGs蛋白，招募负责溶酶体传递的蛋白和介导与溶酶体融合的蛋白。

5)自噬体与溶酶体融合阶段（Fusion）：自噬体与溶酶体融合，首先自噬体外膜与溶酶体膜融合，形成自噬溶酶体（autolysosome）。随后自噬体内膜和内容物被溶酶体内的脂酶和蛋白酶降解为小分子，被细胞重新利用。细胞骨架成分和相关的运动蛋白，栓系因子（Tethering factors），磷脂和特定的SNAREs复合物，已经被确定为确保精确和有效融合的重要角色。

图3

四、自噬相关蛋白

在自噬的发生过程中，有多种自噬相关蛋白可调节和控制自噬形成的不同阶段。迄今为止，科学家已在酵母中鉴定出40余个编码ATG蛋白的基因，并且大多数在酵母和哺乳动物之间高度保守。在哺乳动物细胞中，饥饿诱导的自噬大约受20种核心ATG基因调节，它们在液泡附近被不断募集，并组装形成自噬前体。这些基因的分类和作用（图4）如下：

五、自噬的检测方法

在生理条件下，细胞自噬活性通常较低。但在饥饿、缺氧和疾病等刺激下会显著上调。另外，自噬抑制也与某些疾病相关，如癌症、神经退行性疾病等。选择理想的检测方法对于自噬研究至关重要。常用的观察和检测方法有∶

1、透射电镜法

自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。

表1. 自噬各阶段的形态学特征

2、荧光显微镜观察法

LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。哺乳动物的LC3可分为三种：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B应用广泛。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低（图6）。因此，可以通过荧光显微镜观察内源性LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。

GFP-LC3单荧光和mCherry-GFP-LC3双荧光指示系统

自噬形成时，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白转移至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色或黄色荧光斑点。当自噬溶酶体形成后，酸性环境使GFP荧光淬灭，而mCherry荧光不受影响，自噬溶酶体呈现红色荧光（图7）。因此，可以通过LC3荧光指示系统来监测自噬流。

3、Western Blot检测LC3和p62蛋白的表达量

① 利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化评价自噬形成（图8）。自噬形成时，胞浆型LC3-I会酶解掉一小段多肽，随后跟PE结合转变为膜型的LC3-II。因此可以通过LC3-II/I比值的大小估计自噬水平的高低。

② 除LC3外，其他自噬底物表达量的变化也可以用于监测自噬流。其中，p62是研究广泛的一个自噬底物。在自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解（图9），所以p62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。因此，利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以评价自噬水平。

4、基于Keima蛋白的自噬评价

Keima是一种pH敏感型荧光蛋白，利用它在中性和酸性pH中荧光信号不同的特性，可以直观地反映自噬程 度。将细胞质的Keima传递到溶酶体可反映非选择性自噬，将Keima融合到特定的蛋白(如融合到线粒体靶向序列—mt-Keima)可用于反映选择性自噬。值得注意是，基于keima的检测不能在固定细胞中进行，因为这种检测完全依赖于溶酶体的酸性。

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