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苹果酸合酶(MS)测试盒 BES-BK2080B

苹果酸合酶(MS)测试盒

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苹果酸合酶(MS)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

苹果酸合酶(MS,EC 4.1.3.2)是属于转移酶中酰基转移酶的一类,主要存在于植物和微生物中。MS 是乙醛酸循环的关键酶之一,在 MS 催化下乙醛酸与乙酰辅酶 A 反应生成苹果酸。

测定原理:

MS 催化乙酰 CoA 和乙醛酸产生苹果酸,同时生成辅酶 A,辅酶 A 使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 100 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 25 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 25mL 试剂一充分溶解后使用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 6 mL 试剂一充分溶解后使用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。

2、样本测定在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 100μL 样本、400μL 试剂二,400μL 试剂三和 100μL 试剂四,混匀,立即记录 412 nm 处反应 5min 时的吸光值 A1 和 10min 时的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

MS 活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=147×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=147×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.294×ΔAV 反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104 L / mol /cm;d:比色光径,1 cm;V 样:加入样本体积,0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。



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