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吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒 BES-BK2808B

吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒

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吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

吲哚乙酸(IAA)在吲哚乙酸氧化酶的作用下,被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小,对调节体内吲哚乙酸的水平,起着重要的作用,而影响植物的生长。

测定原理:

在无机酸存在情况下,吲哚乙酸能与 FeCl3 作用,生成红色螯合物,该物质在 530nm 处有最大吸收峰,酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。

自备仪器和用品:

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、1.5mL 离心管、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂五:液体 2mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂六:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。临用前吸取 1mL 试剂五加入试剂六中混匀,待用,避光保存

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 530 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二、试剂三、试剂四置于 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴中保温 20min。

3. 取 1.5mL EP 管若干,操作表如下:

2021091202323512187

2021091202325435432

注意:标准管只需做一次

IAA 氧化酶活性计算公式:

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

IAA 标准曲线公式:y = 1.334x + 0.025 R2 = 0.998 (x 为 IAA 浓度,mmol /L;y 为吸光值)

(1) 按蛋白浓度计算

酶活定义:从开始时加入的 IAA 量减去酶作用后残留的 IAA 含量,即得被酶所催化的 IAA含量。以每 mg 酶蛋白在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U(μmol/h/mg prot)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样×Cpr)÷T=1.5×(A1-A2)÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

酶活定义:以每 g 样本在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U(μmol/h/g 鲜重)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=1.5×(A1-A2)÷W

(3) 按细胞数量计算

酶活定义:以每 1 万个细胞在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U(μmol/h/104 cell)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T=1.5×(A1-A2)÷细胞数量

(4) 按液体体积计算

酶活定义:以每 mL 酶液在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U(μmol/h/mL)=[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总) ÷T=1.5×(A1-A2)V 样总:上清液总体积,1mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02 mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g,T:反应时间,0.5h。

注意事项:

1. 最低检出限为 0.01μmol/mL


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