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乳酸脱氢酶LDH活力测定试剂盒 BES2004CD

LDH Assay Kit/LDH Release Assay Kit

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乳酸脱氢酶LDH活力测定试剂盒

产品描述:

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)是哺乳动物细胞内糖酵解途径的关建酶,存在于大多数组织的细胞内液中,在组织液和细胞外液中的含量很低。例如红细胞中 LDH 的活性比血清中高约 100倍,而血液 LDH 的活性是临床诊断和医学研究中常用的生化指标。另一方面,LDH 可从立体培养细胞释放到培养基中,其释放量可反映细胞经受物理因素或药物处理的损伤程度,常用来评估组织细胞损伤及药物毒性。培养基 LDH 活性监测与 MTT 或 CCK8 方法是目前两种最常用的细胞增殖-毒性检测方法。


原理:

LDH 以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)作为氢受体,使乳酸脱氢生成丙酮酸,丙酮酸与显色剂(2, 4—二硝基苯肼)作用生成丙酮酸二硝基苯腙,其在碱性溶液中呈棕红色,颜色深浅与丙酮酸浓度成正比,由此可推算出乳酸脱氢酶的活性。


适用范围:

用于定量测量血清、组织细胞培养基或组织细胞匀浆裂解液中的 LDH 活性,也常用于评估组织细胞损伤以及药物毒性等。


组成: (100次)

试剂 A:底物缓冲液,10 ml, 4℃ 避光保存 1 年;

试剂 B:11.3 mmol/L 氧化型辅酶Ⅰ溶液,2 ml, –20℃ 保存,4℃可保存 6 周;

试剂 C:1mmol/L 2, 4—二硝基苯肼溶液,10 ml, 4℃ 避光保存半年以上;

丙酮酸钠标准品母液 (5 μmol/ml),0.5 ml, –20℃ 保存;

终止试剂:0.6 mol/L NaOH , 30 ml, 常温保存。


操作步骤:

一、样本处理:

一)液体样品处理:

血清用生理盐水作 1:10 稀释;脑脊液内乳酸脱氢酶活力较低,直接以原液测定即可;其他体液也需 1:10 稀释后测定。

二)细胞处理:

细胞用 1% Triton X-100 裂解,取 10 μl 细胞裂解液用于测定;细胞培养基可直接用于测定。

二、标准曲线的制作:

临用前,将丙酮酸钠标准品母液用底物缓冲液稀释成 2.5、2、1.5、1、0.5、0.25、0.125 μmol/ml 7 个浓度,稀释液 4℃可保存一周。丙酮酸钠 0 μmol/ml 的孔只加 10 μl 底物缓冲液,以此孔作为空白管调零,按照下述操作步骤进行操作,而后在 440nm 波长处读取各吸光度,与其相应的酶活力单位作图,得出标准曲线。

 丙酮酸钠浓度与乳酸脱氢酶活力单位的对应关系丙酮酸钠浓度 (μmol/ml) 0 0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5相当于乳酸脱氢酶活力单位 0 125 250 500 1000 1500 2000 2500


LDH 酶活性测定:

1.取 10 μl 丙酮酸钠标准品或样本加入到微孔板中。

2.将试剂 A 与试剂 B 以 5:1 的体积比混合,取 60 μl 混合液加到各孔,充分混匀,37℃水浴 15 分钟。

3.加入 2, 4—二硝基苯肼溶液 50 μl,与标准品或样本充分混合,37℃水浴 15 分钟。

4.加入 150 μl 终止试剂,充分混合。

5.室温放置 3 分钟后,440nm 波长处测定。


四、结果处理:

体液:作 1:10 稀释后测定的体液实际酶活力单位即是测定的酶活力单位;未经稀释的体液的实际酶活力单位=测定的酶活力单位/10;细胞活力计算:细胞活力用 LDH 释放率来表示,后者值越大,表示细胞活力越差,受损程度越严重。细胞 LDH 释放率(%)=细胞培养基中测定的酶活力单位/(细胞裂解液测定的酶活力单位+细胞培养基测定的酶活力单位)×100%


乳酸脱氢酶活力单位定义:

每 100m1 血清中的 LDH 在 37℃与底物作用 15 分钟,能生成一微摩尔丙酮酸者即为一个乳酸脱氢酶活力单位。以第四管为例,丙酮酸含量为 0.005 微摩尔,如稀释后的血清测定结果相当于第四管的光密度时,因稀释前的血清用量为 0.001ml,换算成 100ml 时就相当于乳酸脱氢酶活力 500 U/dl;如果血清未经稀释,测定结果相当于第四管光密度时,说明 0.01ml 血清在 37℃与基质作用 15 分钟生成0.005微摩尔丙酮酸,换算成100ml血清就相当于产生了50微摩尔丙酮酸,乳酸脱氢酶活力单位为50U/dl,即测得的酶活力单位除以稀释倍数 10 得实际的酶活力单位。


参考值:

 人血清 LDH:190~310U/dl


注意事项:

1.红细胞内乳酸脱氢酶活力较血清内约高 100 倍。故标本有轻微的溶血.测定的结果会比实际的结果高数倍。

2.草酸盐可抑制乳酸脱氢酶活力,故不能用草酸盐抗凝血浆测定。

3.测定结果超过 2500U 时,应将样本继续稀释后重新测定。

4. 该方法以乳酸盐和 NAD+为底物,其优点是乳酸盐及 NAD+底物液稳定,冰箱保存时可稳定半年以上,反应的线性范围较宽。


注意事项:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!

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