Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒
产品描述:
钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 可分别对活细胞和死细胞染色,用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色分析。Calcein-AM 是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂,发绿色荧光(Ex=490nm, Em=515nm),在传统的 Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯(AM)基团,增加了疏水性,使其能够轻易穿透活细胞膜。进入细胞后,Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。与其它同类试剂如 BCECF-AM 和 CFDA 相比,Calcein, AM 细胞毒性极低,是最适合用于活细胞染色的荧光探针,而且不会抑制任何的细胞功能,如增殖和淋巴球的趋化性。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)不能穿过活细胞的细胞膜,仅能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核,并嵌入细胞的 DNA 双螺旋从而产生红色荧光(Ex=535 nm, Em=617 nm),因此PI 仅对死细胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm 激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。而用 545 nm 激发,仅可观察到死细胞。 试剂盒经过优化,单次可进行200µl细胞悬液染色。
组成与储存 :(500 次)
Calcein-AM Solution(2mM) 50μL -20°C 避光干燥保存
PI Solution(2 mM) 150μL -20°C 避光干燥保存
一年有效
操作步骤:
1. 工作液的配制
1)先将低温保存的 Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 PI 溶液(2 mM)平衡至室温。注意:第一次使用可对母液进行分装,以减少反复冻融次数。
2)取 5µl Calcein-AM 溶液 (2 mM)和 12.5µl PI 溶液(2 mM)至 5ml 1xPBS 缓冲液(pH7.4),充分混匀。 得到 Calcein-AM 的工作液浓度 2μM,PI 的工作液浓度 5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同,初次实验建议做梯度实验,以确定Calcein-AM和PI 的最适浓度。梯度筛选的原则为 使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
注意:由于 Calcein-AM 的稳定性比较差,此染色工作液必须现配现用,且在当天用完。
2. 染色步骤
2.1 贴壁细胞,先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞,离心收集细胞(1000 rpm,3min)。悬浮细胞,直接离心(1000 rpm,3min)收集细胞。
2.2 去上清,用 1xPBS 缓冲液(pH7.4)洗涤细胞 2~3 次,去除残留的酯酶活性。
注意:由于培养基中的血清等含有酯酶,Calcein-AM 遇水会分解,导致空白上升,所以需要数次离心,用 PBS 洗涤数次直到完全洗净。
2.3 制备细胞悬液,使其密度为 1×10 5~1×10 6 细胞/ml。
2.4 取 100µl 染色工作液加入 200µl 细胞悬液内,混匀,37℃孵育 15min。注意:如果需要,可延长孵育时间至 30min。
2.5 荧光显微镜下使用 490±10 nm 激发滤片同时检测活细胞(黄绿色荧光)以及死细胞(红色荧光)。另外,使用 545nm 的发射滤片仅能观察到死细胞。也可以直接在荧光酶标仪下使用合适的滤片进行检测。
注意:可以使用以下方法优化两种荧光染料的最佳工作浓度。
a) 在 0.1%皂苷或 0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育 10 分钟或在 70%乙醇中孵育 30 分钟制备死细胞;
b) 用 0.1-10µM 的 PI 溶液进行死细胞染色,以得到仅对细胞核染色,而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。
c) 用 0.1-10µM 的 Calcein-AM 进行死细胞染色,以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色。
说明 :
1)由于 Calcein-AM 对湿度非常敏感,若是 Calcein-AM 溶液每次取完需要量后,必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量,分装密封保存。Calcein-AM 工作液必须现配现用。
2)碘化丙啶(PI)操作时一定要注意防护。若接触到皮肤,需要立即用自来水清洗。
3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。