活性氧ROS检测试剂盒(红色荧光)
产品描述:
本试剂盒利用荧光探针 DHE 进行活性氧检测。DHE 可自由透过活细胞膜进入细胞内,在细胞质中呈蓝色荧光,被细胞内的 ROS 氧化后形成氧化乙啶掺入染色体 DNA 中,使细胞核呈现明亮的红色荧光。在激发波长 535nm,发射波长 610nm 附近,使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测荧光强度,测定细胞内活性氧水平。具有背景低、灵敏度高、线性范围宽、使用方便等优点,是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS 经典检测方法。
适用范围:
贴壁细胞、悬浮细胞、新鲜动物组织
工作波长:
最佳激发波长 480-535nm,最佳发射波长 590-610nm
组成:
0.2 ml, 5 mM DHE,20 ºC 避光保存 一年有效
所需设备:
流式细胞仪、荧光酶标仪、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计等操作步骤:
一、细胞样本:
1. 收集细胞,进行活性氧测定
1.1 细胞收集:悬浮细胞:2000rpm,离心 5min,收集沉淀,用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤2次,1000rpm,离心 5min,弃上清,取细胞沉淀;贴壁细胞:吸去培养液,用0.01MPBS 或无血清培养液反复吹打,使细胞层全部进入 PBS 或培养液中,收集细胞悬液,用0.01MPBS 或无血清培养液洗涤 2 次,1000rpm,离心 5min,弃上清,取细胞沉淀;
1.2 加入 DHE 探针:用稀释好的 DHE 荧光探针重悬细胞沉淀,一般情况下,细胞密度要求1*106-2*107/ml,推荐探针初始工作浓度为 10 µM(DHE 工作浓度可在 1µM~100 µM范围内,需进行预实验确定最适浓度)。
1.3 37 ºC 孵育细胞 10 分钟~90 分钟。通常情况下,10-30 分钟即可。注意:孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下,使探针与样本充分接触。1.4 1000g,离心 5min,去上清收集细胞沉淀,用 PBS 缓冲液洗涤 2 次,重悬细胞。1.5 进行荧光检测,以荧光度数值表示结果。
2. 不收集细胞,直接将探针加入培养基测定
2.1 加入 DHE 探针:去除细胞培养基上清,加入用无血清培养液稀释好的DHE 探针(推荐探针终浓度为 10 µM),加入探针的体积以能盖住细胞为宜,通常 6 孔板单孔不少于500 µl。
2.2 37 ºC 孵育细胞 10 分钟~90 分钟。通常情况下,10-30 分钟即可。注意:孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下,使探针与样本充分接触。
2.3 弃去上层培养液,用无血清培养液或 0.01M PBS 反复吹打,使细胞层全部进入PBS 或培养液中。
2.4 收集细胞悬液,用 0.01M PBS 或无血清培养液洗涤 2 次,去除未进入细胞内的探针,1000rpm,离心 5min,弃上清,收集细胞沉淀,用 PBS 缓冲液洗涤 2 次,重悬细胞。2.5 进行荧光检测,以荧光度数值表示结果。
二、动物组织样本
1.1 细胞悬液制备:可采用单细胞悬液制备仪或传统的组织处理方法如:酶解法、研磨法等制备单细胞悬液;
1.2 加入 DHE 探针,加入 DHE 探针:去除细胞培养基上清,加入用无血清培养液稀释好的DHE探针(推荐探针终浓度为 10 µM)。
1.3 37 ºC 孵育细胞 10 分钟~90 分钟。通常情况下,10-30 分钟即可。注意:孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DHE 浓度等有关。可以每隔 5min 颠倒混匀一下,使探针与样本充分接触。1.4 1000g,离心 5min,去上清收集细胞沉淀,用 PBS 缓冲液洗涤 2 次,重悬细胞1.5 进行荧光检测,以荧光度数值表示结果。
注意事项:
(1)开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集于管底,避免开盖时染液损失。
(2)要设有无 DHE 孵育的对照,即不加探针,只用 0.01M PBS 重悬的细胞。
(3)荧光探针标记后,一定要洗净残余的未进入细胞内的探针,以避免背景升高。多次清洗时注意操作规范,避免将细胞洗掉。
(4)对于药物处理(孵育)时间较短的细胞(2 小时以内、也有建议 4 小时以内),可以先用荧光染料进行标记,后用药物刺激细胞后。对于药物处理时间较长的细胞(超过4 小时或6 小时以上),建议先用药物处理(刺激)细胞,后用探针标记。
(5)DHE 在光照和空气中易被氧化,保存和操作中应注意避光。
(6)对不同的细胞和组织,应选择合适的孵育时间和浓度,以观察 ROS 的变化。
(7)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。