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细胞核-胞浆蛋白-胞膜制备试剂盒
产品描述：
本试剂盒能够从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮细胞中制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。其独特的试剂成分与优化的制备方案使胞核-胞浆-胞膜制备过程简单易行，无需特殊设备和超速离心，可在1小时内完成。应用本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器膜如线粒体、内质网及质膜的混合物，得到的细胞核是完整的未裂解细胞核，胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备得到的产物纯度可胜任后续的免疫沉淀、蛋白印迹、2-D gel、酶活性检测和受体分析等实验。
组成:（以下是50次规格用量）
CER (Cytosol Extraction Reagent) 25ml
MER (Membran Extraction Reagent) 2.5ml
NER (NuclearExtractionReagent) 50ml Suspension Buffer 10m
储存：
各组分4oC 有效期12个月
规格：
50次 100次
操作步骤：
一.样本预处理：
收集细胞：（在每一次制备过程中，使用等量的细胞数将明显提高后续检测结果的一致性，因此建议在制备前对细胞准确计数）
1. 贴壁细胞：用PBS缓冲液冲洗细胞平皿，用胰蛋白酶消化细胞。800g离心5-10分钟，弃上清，用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。
2. 悬浮细胞：800g离心5-10分钟，弃上清。用PBS缓冲液重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。
以下制备过程要在4oC或冰水浴中进行
二.组织细胞匀浆裂解
1.细胞匀浆裂解：
向每1x107个细胞或每100µl（细胞离心后的体积）细胞沉淀中加入500µlCER试剂，震荡重悬，冰浴2分钟。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中上下手动匀浆20-30次。
注意：此破碎细胞步骤为关键环节。要使用1-3ml小容积玻璃匀浆器，须选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关，可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应小于5%。
2.组织块匀浆裂解：
取250mg哺乳动物新鲜或-80oC冻存组织块放入冰预冷的玻璃匀浆器内，加入500µlCER试剂。用研杵捣碎组织块，上下手动匀浆20次，冰浴10分钟，然后上下手动匀浆7次。
注意：与培养细胞特别是贴壁细胞相比，组织块中的细胞在匀浆时较易破碎，因而并非必须选择间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密，会使组织匀浆困难，可选用研杵与套管稍松的匀浆器，破碎效果与组织细胞类型有关，可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。
三.粗提物制备：
取约500µl裂解物，转移到新的离心管中，800g ,4oC离心5分钟。此时，细胞核的粗制品沉淀在管底，上清为胞膜-胞浆混合物。
四.胞膜胞浆制备：
1）将步骤三获得的上清转移到新的离心管中，估计上清的体积；2）加入上清液1/10体积的MER与上清液混合，冰浴5分钟；3）14,000rpm，4oC离心30分钟；4）取上清液转移到新离心管中，此为胞浆组分；5）沉淀为胞膜组分，含有细胞膜和亚细胞器碎片，可短暂离心除尽液体，用50-100µl Suspension Buffer 或自备溶液重悬胞膜。
五.细胞核制备：
1）向步骤三中获得的细胞核粗提物中加入500µl NER，震荡重悬；2）4,000g,4oC离心5分钟，弃上清；3）再次加入500µl NER洗涤细胞核沉淀，重复上述离心步骤，离心后的上清应为清亮； 4）弃上清，除尽液体。用50-100µlSuspension Buffer重悬细胞核，得到完整和没有破碎的细胞核。用户也可以使用自备溶液如SDS上样缓冲液直接裂解细胞核。
说明：
1.Suspension Buffer 不含去垢剂，重悬于Suspension Buffer 中的胞膜或胞核组分呈不溶解状态是正常的，用户可用自备溶液重悬胞膜或胞核成分。如果进行蛋白印迹、2-Dget等实验，用户可用SDS上样缓冲直接裂解细胞膜或细胞核成分。对于进行免疫共沉淀实验来说，可用RIPA裂解液（C1053）重悬胞膜或胞核组分。
2.胞浆组分可直接进行蛋白定量。纯的胞膜和胞核蛋白浓度很低，但与胞浆蛋白浓度成比例，因而不需要单独定量，如需定量可加入TritonX-100至终浓度1%或SDS至终浓度0.5%用BCA法蛋白定量。
3.用SDS-PAGE Loading 缓冲液裂解细胞核后，DNA释放会使核裂解物十分粘稠，可95oC加热5分钟，高速震荡打断DNA，重复加热2-3次。
4.如果进行凝胶阻滞（EMSA）实验，建议使用普利莱P1200产品，该试剂盒可直接提取可溶性核蛋白.
5.试剂盒各组分中未添加蛋白酶抑制剂，用户可自行选择添加，通常4oC快速操作不加蛋白酶抑制剂不会出现问题。
6.沉淀胞浆蛋白方法：估算胞浆蛋白组分的体积，加入1/3体积30%三氯醋酸水溶液，-20oC沉淀1小时或过夜。5,000g,4oC离心10分钟，弃上清，空气略干沉淀。用1xSDS上样缓冲液溶解沉淀，95oC加热5分钟，上样电泳。