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BCA法微量蛋白定量试剂盒
产品描述：
Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
组成与储存：
(1) BCA Reagent 100ml，室温保存；
(2) Cu Reagent 2.5ml，室温保存；
(3) BSA standard 4mg/ml 1ml，−20ºC冻存。1.5年有效。
可进行500次微板(microplate)测定或100次1ml比色杯测定。
所需设备：比色计、酶标仪、或微板比色仪，最佳工作波长562nm，可在540-590nm之间。
工作溶液(Working Reagent, WR)配制：将50体积BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即为WR工作试剂，呈嫩绿色，立即使用或者4℃保存不超过一天。
标准蛋白溶液配制：用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS、或与待测蛋白样品匹配之缓冲液进行倍比稀释,得到BSA标准溶液80、40、20、10、5、2.5、1.25µg/ml。
蛋白测定
微量蛋白质浓度线性检测范围为1-100µg/ml。标准测定用1 cm光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积1.2ml，用比色计测定。微板测定用96孔板，反应终体积240µl，用酶标仪、微板比色仪测定。
1. 标准测定：将0.2ml标准品或待测样本与0.8ml WR工作溶液混合。微板测定：将50µl标准品或待测样本与200µl WR工作溶液混合。
2. 37ºC反应30min；也可25ºC室温2小时或过夜。
3. 将反应管温度冷却至室温。测定562nm (可在540-590nm之间)光密度(OD)值。
4. 绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml)，Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel拟合曲线并计算蛋白浓度。
表1 标准测定和微板测定方案的加样量和比例
微板(microplate)测定方案 | 标准比色杯测定方案 | ||||
标号 | 蛋白浓度(µg/ml) | 标准或待测蛋白体积 (µl) | WR工作试剂(µl) | 标准或待测蛋白体积 (ml) | WR工作试剂(ml) |
1 | 0 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
2 | 1.25 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
3 | 2.5 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
4 | 5 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
5 | 10 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
6 | 20 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
7 | 40 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
8 | 80 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 |
待测样品 | 50 | 200 | 0.2 | 0.8 | |
注意事项
1. 37ºC 30min或25ºC室温反应2小时对测量较为便利，但严格来讲此时反应尚未达到终点，通常每10min OD562值升高约2.3%。然而，通常在10min内可以测定30管而不明显影响测定精度。
2. 微量蛋白质定量试剂盒 (BCA法)检测范围为1~100µg/ml。
3. BCA法在样品含有脂类时光吸收值偏高。样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10mM不能使用BCA方法，葡萄糖浓度大于10mM时可用改良Lowry法蛋白定量试剂盒#P1512，EDTA大于10mM的样品可用Bradford法蛋白质定量试剂盒(#P1510)。另外，蛋白质样品经液体样品蛋白抽提试剂(#P1255)沉淀后，可彻底去除干扰BCA法、Bradford法、和Lowry法蛋白测定的物质。
4. 欲使测量能耐受下面表2所提示的最大干扰物质浓度，并保持测量精度，应在蛋白标准管中加入相应浓度的干扰物质，但会给操作带来不便。
5. 可测量吸附于固相支持物乳酶标板、琼脂糖、亲和层系凝胶上的蛋白。
6. 每次测定应该制备单独的标准曲线。
表2 BCA法物质干扰及耐受的最大浓度
Buffer Systems | Sodium phosphate 25 mM |
Bicine, pH 8.4 20 mM | Sucrose 40% |
Bis-Tris, pH 6.5 33 mM | Sodium ortho-Vanadate in PBS, pH 7.2, 1 mM |
Calcium chloride in TBS, pH 7.2 10 mM | Urea 3 M |
CHES, pH 9.0 100 mM | Chelating agents |
Cobalt chloride in TBS, pH 7.2 0.8 M | EDTA 10 mM |
Ferric chloride in TBS, pH 7.2 10 mM | EGTA,any level, not compatible |
HEPES 100 mM | Sodium citrate 200 mM |
MOPS, pH 7.2 100 mM | Detergents |
Nickel chloride in TBS 10 mM | Brij-35 5% |
PBS; no interference | Brij-52 1% |
NaCl (0.15 M), pH 7.2, no interference | CHAPS 5% |
PIPES, pH 6.8 100 mM | CHAPSO 5% |
Sodium acetate, pH 4.8 200 mM | Deoxycholic acid 5% |
Sodium citrate, pH 4.8 or pH 6.4 200 mM | Nonidet P-40 (Igepal CA-630) 5% |
Tricine, pH 8.0 25 mM | SDS 5% |
Triethanolamine, pH 7.8 25 mM | Span 20 1% |
Tris 250 mM | Triton X-100 5% |
TBS buffer, no interference | Triton X-114 1% |
1 x SDS-PAGE loading buffer, no interference | Tween-20 5% |
Zinc chloride (10 mM) in TBS, pH 7.2, 10 mM | Tween-60 5% |
Buffer Additives | Tween-80 5% |
Ammonium sulfate 1.5 mM | Zwittergents 1% |
Aprotinin 10 mg/L | Reducing & Thiol Containing Agents |
Glucose 10 mM | Dithioerythritol (DTE) 1 mM |
Glycerol 10% | Dithiothreitol (DTT) 1 mM |
Guanidine•HCl 4 M | 2-Mercaptoethanol 1 mM |
HCl 100 mM | Tributyl Phosphine 0.01% |
Imidazole 50 mM | Solvents |
Leupeptin 10 mg/L | Acetone 10% |
PMSF 1 mM | Acetonitrile 10% |
Sodium azide 0.20% | DMF 10% |
Sodium bicarbonate 100 mM | DMSO 10% |
Sodium chloride 1 M | Ethanol 10% |
Sodium hydroxide 100 mM | Methanol 10% |