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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶试剂盒 BES-BK2215B

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶试剂盒

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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中,催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的关键酶。

测定原理:

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PEPCK 活性。

需自备的仪器和用品:

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 18 mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:液体 16.5uL×1 支,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 支, -20℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂四的配制:临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。

5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂四和 180μL 工作液,立即混匀,记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

注意:在该试剂盒中,若 ΔA 大于 0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使 ΔA 小于 0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PEPCK 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)PEPCK 活力计算

单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=3215×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)PEPCK 活力计算

单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=6430×ΔA2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=6430×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=12.86×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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