UDPG焦磷酸化酶(UPG)测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
UDPG 焦磷酸化酶是生物体糖原合成过程中的关键酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,将 1-磷酸葡萄糖与 UTP 分子合成为 UDP-葡萄糖(UDPG)。
测定原理
UGP 可逆催化反应生成 1 磷酸葡萄糖,在磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将 NADP 转化为 NADPH,340nm 的吸光值增加速率反映了 UGP 活性。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板试剂组成和配制
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂五:液体 2mL×1 瓶,4℃保存。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。2. 细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 4℃,10000g 离心 10min,取上清置冰上待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作
1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2. 取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 100μL 试剂一,20μL 试剂二,20μL 试剂三,20μL试剂四,20μL 试剂五,20μL 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 30s 的吸光值 A1 和 330s的吸光值 A2,△A=A2-A1
计算公式
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W
(3)按照细胞数量计算
酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /104cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按照样本蛋白浓度计算
酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算
酶活单位定义:每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /g 鲜重)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W(3)按照细胞数量计算
酶活单位定义:每 104个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /104cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷细胞数量
(4)按照液体体积计算
酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。
UGP(nmol/min /mL)=ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=643.08×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g