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外泌体纯化试剂盒-SuperEV0.5 BES2007EXO

是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡 (Extracellular Vesicles,EVs)。

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外泌体纯化试剂盒-SuperEV0.5 

保存与应用 

【保存条件】 

常温或 4℃运输,收到试剂盒后,SuperEV 0.5 超纯色谱柱需直立放置,2-8℃保 存,有效期 12 个月。请勿冷冻!

【应用范围】

本产品只用于科学研究,不能用于临床诊断。
1. 本试剂盒包括超纯色谱柱(SuperEV0.5)和 EVs 浓缩柱,首先通过超纯色谱 柱基于尺寸排阻色谱原理,实现血浆/血清或浓缩的样本中 EVs 与蛋白质的分 离,然后通过 EVs 浓缩柱基于凝胶树脂层析实现馏分的浓缩和进一步纯化。
2. 纯化的 EVs 可用于鉴定(NTA,TEM,FACS 和 Western Blot),蛋白质谱分 析,R

外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡 (Extracellular Vesicles,EVs)。外泌体普遍存在于多种体液中,其内容物丰富, 包括蛋白质、脂质和核酸等,在细胞间信息交流中发挥着重要作用,主要参与免 疫抗原呈递,神经递质传递,脂类代谢及细胞信号转导等过程,并与多种疾病的 发生、发展、治疗及预后密切相关。
尺寸排阻色谱法(Size Exclusion Chromatography,SEC)被认为是从不同样 本中分离和纯化 EVs 的最佳方法之一,因为它能够快速而有效地将 EVs 从复杂 样本中分离出来,并能保持 EVs 的原始形状和生物学功能。开发了用 于分离 EVs 的不同规格的 SEC 柱:SuperEV0.5,SuperEV1.0 和 SuperEV3.0, 适合不同样本和体积的 EVs 分离。针对获得的馏分再通过 EVs 浓缩柱,基于凝 胶树脂层析实现馏分的浓缩和进一步纯化。此种组合得到的 EVs 不仅纯度更高, 优于超速离心,而且保持 EVs 的生物学功能,适合 EVs 蛋白质质谱分析,RNA 高通量测序和 EVs 的体内外细胞实验等。另外,还可用于大量制备适合于临床 应用的 EVs 产品。

试剂盒组成和说明

2022092108530514443

需自备试剂 
PBS 缓冲液,经 0.22μm 滤膜过滤  
纯水,经 0.22μm 滤膜过滤  
0.45-0.80μm 针头过滤器
20%乙醇水溶液  收集管(烧杯,普通离心管等) 主要特点 

耗时短,大约需要 1 个小时。 

操作简便,无需特殊设备,如超速离心机等。 

重复性好,超纯色谱柱可重复使用 5 次,EVs 浓缩柱为一次性使用。 

操作温和,最大程度保持 EVs 完整形态结构和生物学功能。 

回收率高,达到 70-85%。 

浓度高,能浓缩 25-50 倍。 

纯度高,总蛋白去除约 99.9%,脂颗粒去除约 90%。

操作方法

 第一部分 通过超纯色谱柱实现 EVs 的分离
1. 柱平衡
从冰箱中取出 SuperEV 0.5 超纯柱,垂直固定,如果无合适的垂直固定装置, 可从我公司购买配套的固定组件。室温放置至少 30 分钟, 使柱子温度充分平衡到室温(18-28℃),温度过高过低,柱体可能会引入气泡, 影响分离效果。使用的 PBS 缓冲液,同样平衡至室温。
注意

柱子平衡至室温前,不要打开顶盖和底盖。

柱子第一次使用,上筛板与填料表面可能存在间隙,这是储存过程中填料沉降造成的, 不影响分离性能,实验前将筛板向下垂直推到填料表面即可。  尽量用当天新配的 PBS, 经 0.22μm 膜过滤,避免引入微生物和颗粒物,以免堵塞筛板。
将收集管(烧杯或普通离心管)放置在柱子下方,先打开顶盖,用移液器吸 弃上方的保存液,加入约 5mL 超纯水(经 0.22μm 滤膜过滤),取下底盖冲洗柱 子,待液体全部进入筛板,出口无液体流出,继续加入 15mL PBS 冲洗。整个冲 洗过程始终保持顶部筛板湿润,避免柱体变干。冲洗完成后,盖上底盖,加入少 量 PBS 等待后续操作。

1. 样本处理

样品上样量

2022092108571549170

样品处理

2022092108573523847

3. 样品上样和 EVs 收集

用移液器吸弃筛板上方的 PBS,取下柱子底盖,在筛板上方加入不超过 0.75mL(最适 0.5mL)的样品,柱子下方放置 5.0mL 离心管进行第 1 馏分的收 集。待样品全部进入筛板后,再加入一定量的 PBS(PBS 量=3.5mL-样品上样量)。 待液体全部进入筛板下方,出口无液体流出,收集完毕。收集的第 1 馏分为空隙 体积,大约 3.5mL,该馏分不含 EVs。
注意

加入样品后,必须等所有样品进入筛板后,才能继续加入 PBS,避免样品被稀释。 

加入 PBS 的量为 3.5mL-样品上样体积,如上样量为 0.5mL 时,加入 PBS 3mL,上样量 为 0.75mL 时,加入 PBS 2.75mL。 继续加入 PBS 进行洗脱,用 1.5mL 离心管收集馏分。每次加入 0.5mL PBS, 待洗脱液全部进入筛板后,出口无液体流出时,该馏分收集完毕。再加入下一个 0.5mL PBS 进行收集。每个馏分收集体积为 0.5mL。EVs 主要集中在馏分 2-4, 总体积约为 1.5mL。
注意

整个洗脱过程始终保持顶部筛板湿润,避免柱体变干。
不同类型样品可能会有不同的洗脱谱和纯度,建议初次使用时,对收集的馏分做 EVs和蛋白浓度测定。

4. 柱体冲洗

含 EVs 的馏分收集完毕后,用不少于 15mL PBS 对柱体进行冲洗,冲洗后的 柱子可直接用于下一个样品处理或加入保存液,2-8℃储存。 保存液:20%乙醇或 0.05%(w/v)叠氮钠水溶液。 注意:当分离的 EVs 馏分用于 RT-PCR 或高通量测序时,为避免交叉污染,建议一根柱子 只用一次或仅重复用于同一样品。

5. 清洗和再生

变性蛋白或脂蛋白在柱子冲洗过程中可能无法完全被洗脱,积累过多会对分 离的纯度产生影响,可按以下方法进行再生:10 mL 0.5M NaOH 清洗,然后用 PBS 冲洗柱子,直至流出液 pH 为中性,一般需 20-30mL PBS 缓冲液。
注意:当柱子颜色有变化或流速明显下降时,建议进行清洗和再生。

第二部分 通过 EVs 浓缩柱实现馏分的浓缩和纯化 

1. 外泌体结合

取上述馏分大约 1.5mL 加入到离心管中(试剂盒不提供),加入 1/10 体积的 结合缓冲液(如 0.15mL),盖紧盖子,颠倒混匀。
2. EVs 浓缩和纯化
吸取 100μl 结合树脂(吸取前彻底混匀结合树脂,快速吸取)加入步骤 1 中 的离心管中,盖紧盖子,室温颠倒混匀 15min 后,1,500×g 室温离心 3min。将离 心管从离心机中取出,用移液器取 0.5ml 上清液(不要弃掉),小心倒掉剩余上 清液,用移液器中的液体(0.5ml)轻轻吹起树脂,全部转移至纯化柱中(已放 入收集管),静置 2min,3,000×g 室温离心 2min,弃去滤液及收集管,将纯化柱 放入 1.5ml 离心管中。

3. EVs 洗脱
向纯化柱中加入 100μL 洗脱液,静置 5min,500×g 室温离心 2min,将滤液 重新加入到纯化柱中,静置 2min,500×g 室温离心 2min,最后 3,000×g 室温离心 2min,所得滤液即为浓缩的 EVs。 提取的 EVs 可直接应用于下游实验,或者 2-8℃保存一周,-20℃或-80℃保存大 约三个月。

用途:该产品仅验使用,未经允许不得用于其它用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。



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