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外泌体提取和RNA分离试剂盒(细胞上清或尿液) BES2002REXO

是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡 (Extrocellular Visicles,EVs)。

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¥ 1125.00 /盒
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外泌体提取和RNA分离试剂盒(细胞上清或尿液)

保存与应用 

【保存条件】 

本试剂盒低温下运输,裂解液 B、洗涤液 B、洗脱液 B 及耗材室温保存(15-25℃), 其它试剂应在 2-8℃下保存,可保存 12 个月。  

【应用范围】

本产品只用于科学研究,不能用于临床诊断。 本产品仅适用于细胞培养上清或尿液中外泌体提取和 RNA 分离。

产品介绍

外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡 (Extrocellular Visicles,EVs)。外泌体普遍存在于多种体液中,其内容物丰富,包 括蛋白质、脂质和核酸等,在细胞间信息交流中发挥着重要作用,主要参与免疫 抗原呈递,神经递质传递,脂类代谢及细胞信号转导等过程,并与多种疾病的发 生、发展、治疗及预后密切相关。
研究表明,胞外膜性囊泡(包括外泌体)内容物中富含不同类型 RNA(mRNA 和 microRNA 等)。microRNA(miRNA)在基因转录和转录后调节方面起重要作 用,与疾病的发生、发展密切相关,因此,某些外泌体 miRNA(exo-miRNA)可 以作为疾病的新的治疗靶标和诊断生物标记物。
外泌体提取和 RNA 分离试剂盒(Exosome Extraction & RNA Isolation Kit) 首先利用专门设计和表面修饰的树脂来捕获(浓缩)样本中的外泌体,根据外泌 体的结构特点,树脂可快速有效地与外泌体结合,进而分离(浓缩)样本中外泌 体,然后采用酚/胍盐方法提取已分离外泌体中总 RNA(含有 mRNA 和 miRNA), 利用核酸特异吸附柱(Spin Columns),可方便、快捷地纯化和洗脱外泌体 RNA, 获得的 RNA 可直接用于下游应用,如 realtime RT-PCR,Northern blot,芯片表 达谱分析,NGS 测序等。

试剂盒组成和说明

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使用前先在每瓶洗涤液 A (Wash Solution A)中加入 45ml 无水乙醇,混匀,并在瓶标签 上标记“√”,每次使用后立即盖紧瓶盖。
【注意事项】
1. 裂解液 A 在使用前检查是否有盐沉淀,使用前先恢复室温,建议在使用前 37℃ 水浴 10 分钟,混合均匀,无沉淀,溶液清澈。
2. 各试剂使用前请颠倒混合均匀,尤其是结合树脂彻底混匀后快速吸取。
3. 本试剂盒所有离心如未明确说明则均在室温下进行。
4. 预防 RNase 污染,应注意以下几方面:
经常更换新手套,防止皮肤表面 RNase 污染。
使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA 释放后在裂解液中不会被 RNase 降解,但提取后继续处理过程中应使 用不含 RNase 的塑料盒或玻璃器皿,玻璃器皿可在 150℃烘烤 4h,塑料器皿 可在0.5M NaOH 中浸泡10 min,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。
配制溶液应使用无 RNase 的水(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入 DEPC 至 终浓度 0.1%(v/v),放置过夜,高压灭菌)。
5. 需要自备试剂:96-100% 乙醇。

操作方法

一、外泌体提取

1. 样本预处理

1. 样本预处理 对于冻存的细胞培养上清或尿液,室温或 25℃水浴解冻,将完全融化的样 品置于冰上;对于新鲜的细胞培养上清,收集样品后置于冰上,3,000×g,4℃离 心 10min,去除细胞或细胞碎片,离心后将上清吸入新管中

2. 外泌体结合

吸取 10ml 上述处理的细胞培养上清或尿液于 15ml 离心管中(试剂盒不提 供),加入 1.0ml 的结合缓冲液 C,盖紧盖子,颠倒混匀。

3. 外泌体浓缩

吸取 400μl 结合树脂 C(吸取前彻底混匀结合树脂,快速吸取)加入步骤 2 的 15ml 离心管中,盖紧盖子,室温颠倒混匀 15min 后,1,500×g 室温离心 2min。 轻轻将离心管从离心机中取出,用移液器取 400μl 上清液(不要弃掉),小心倒 掉剩余上清液,用移液器中的液体(400μl)轻轻吹起树脂,全部转移至纯化柱 A 中(已放入收集管),静置 2min,2,000×g 室温离心 2min,弃去滤液,将纯化 柱 A 放回收集管中。

4. 外泌体洗涤

取 500μl 洗涤液 C 加到纯化柱 A 中(已放入收集管),静置 3min,3,000×g 室温离心 2min,弃去滤液,重复洗涤一次。

5. 外泌体洗脱

将纯化柱 A 转移至低吸附蛋白的 2ml 离心管中(试剂盒不提供),加入 400μl 洗脱液 C,静置 5min,300×g 室温离心 2min,将滤液重新加入纯化柱,静置 2min, 最后 3,000×g 离心 2min,离心管中所得液体即为提取的外泌体溶液。

二、外泌体 RNA 分离
6. 外泌体 RNA 释放
量取分离的外泌体,加入等体积(约 380μl)的裂解液 A,涡旋振荡 30sec, 室温放置 5min,使得核酸蛋白复合物完全分离。室温 12,000×g 离心 10min, 取上清,转入一个新的 1.5ml 无 RNase 离心管中(试剂盒不提供)。
加入 100μl 裂解液 B,剧烈振荡 30sec,室温放置 5min,12,000×g 离心 15min, 样品会分成三层:黄色的有机相,中间层和无色的水相,RNA 主要在水相 中(上层),把水相转移到新的 1.5ml 无 RNase 离心管中(试剂盒不提供)。 (避免吸取中间层),进行下一步操作。
量取转移液体积,缓慢加入 1.5 倍体积预冷的无水乙醇(如 500μl 的转移液 加 750μl 无水乙醇),混匀(此时可能会出现沉淀)后,室温放置 5min。
注意:裂解液 A 在使用前应恢复室温,为了提高提取效率建议使用前 37℃水浴 10 分钟后 使用。
7. 外泌体 RNA 分离
将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱 B 中(已放入收集管),每次上柱体 积不得大于 700μl,可分多次完成),室温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,弃滤 液,将吸附柱 B 放回收集管中。
8. 外泌体 RNA 洗涤
向吸附柱 B 加入 500μl 洗涤液 A(请检查是否已加入指定量的无水乙醇), 室温静置 2min,8,000×g 离心 30sec,倒掉收集管中的滤液,将吸附柱放入收集 管中,重复洗涤 1 次。将吸附柱 B 于 12,000×g 再离心 2min,去除残余液体。打 开 RNA 吸附柱盖子,于室温放置 5-10min,以彻底晾干吸附材料中残余的洗涤 液。
注意:这一步的目的是将吸附柱中的残余的洗涤液去除,洗涤液中的乙醇的残留会影响后 续的酶反应(酶切、PCR 等)实验。
9. 外泌体 RNA 洗脱
将吸附柱 B 转入新的 1.5 ml 离心管中(试剂盒提供),向吸附柱中间位置 悬空滴加 50-100μl 洗脱液 A,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,离心得到的 溶液再加入吸附柱中,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min,最后离心管中液体 为提取的外泌体 RNA,可直接应用于下游实验,或保存在-80℃。
注意:洗脱液体积不应小于 50μl,体积过小会影响回收效率,为增加 RNA 的得率,可将离 心得到的溶液再加入吸附柱中,室温放置 2min,12,000×g 离心 2min。洗脱液的 pH 对于洗 脱效率有很大影响,若用水做洗脱液应保证 pH 值在 7.0-8.5 范围内,pH 值低于 7.0 会降低 洗脱效率,且 RNA 产物最好立即使用,或保存在-80℃,以防止 RNA 降解。

用途:该产品仅验使用,未经允许不得用于其它用途!以实际收货产品说明书为准,网站说明书仅供参考。



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