外泌体表面修饰试剂盒（SA-Biotin）

保存与应用 

【保存条件】 

干冰或冰袋运输，收到试剂盒后按不同组分分别在 2-8℃或-20℃下保存。有效期 6 个月， 使用前请详细阅读说明书。

【应用范围】

本产品只用于科学研究，不能用于临床诊断和治疗。
本产品适用于生物素化的蛋白、多肽、小分子和核酸进行外泌体表面修饰。

产品介绍

外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡。外泌体内容物丰 富，包括蛋白质、脂质和核酸等，在细胞间信息交流中发挥着重要作用，并与多种疾病的发 生、发展、治疗及预后密切相关。
作为天然的胞间信息载体，外泌体免疫原性低，生物相容性高，在人体血液中比较稳定。 能够利用增强渗透滞留效应（Enhanced Permeation and Retention effect，EPR），有选择性的 渗透和滞留在肿瘤或炎症组织部位，可穿透血脑屏障等。不仅可以通过其内源内容物直接对 受体细胞进行治疗，也可以作为药物载体，递送化学药物、蛋白质、多肽及基因药物，在医 疗领域具有巨大的应用潜力。
为了增强外泌体的治疗效果，降低对正常细胞的毒害，需提高外泌体的靶向递送能力， 目前科研常用方法是基因改造分泌外泌体的细胞，利用重组克隆质粒，在细胞中表达靶向蛋 白或多肽-外泌体膜蛋白复合体，收集释放的外泌体，来获得靶向外泌体，但该方法修饰效 率低，且部分细胞转染困难，难以大规模制备。
生物素和链霉亲和素之间具有极高的亲和能力，反应高度专一，形成复合物的解离常数 很小，呈不可逆反应性，产物稳定性高，目前生物素-亲和素系统在生物领域已成为了一种 通用普适的研究方法。
本试剂盒首先通过化学连接的方法，将生物素偶联在外泌体表面，通过 SEC 分子排阻 柱去除游离的生物素，得到大量纯净的生物素化外泌体。生物素化的外泌体先通过与链霉亲 和素结合（含有 4 个生物素结合位点），然后再与带有生物素标记的蛋白、多肽、小分子和 核酸进行连接，最后实现蛋白、多肽、小分子、核酸在外泌体表面的修饰（靶向）。
本试剂盒反应条件温和，生理条件下即可发生反应，反应特异性好，无有害副产物，不 损伤外泌体膜结构，也不影响外泌体的生物活性和功能，为外泌体表面修饰提供了一个高效、 通用的修饰平台。

试剂盒组成和说明

注意：纯化柱内含有保存液，请竖立保存。|
需自备的试剂和设备
1. 二甲基亚砜（DMSO）
2. PBS 缓冲液（pH 7.2-7.6）
3. 0.22um 滤膜
4. 收集管（烧杯，2mL 和 mL 离心管）
5. 旋转混匀仪或震荡混匀仪 6. 恒温培养箱（37℃）
【注意事项】
1. biotin linker 易水解，使用前需室温放置 10 分钟，平衡至室温，避免冷凝水凝结，使用 后请立即盖好旋紧，用封口膜密封。
2. 外泌体缓冲液中避免含有 Tris、甘氨酸等带胺的物质。
3. 可以对任何来源的外泌体进行修饰，包括细胞培养液和体液(如，血清、血浆、尿液、 CSF 或唾液) 提取的外泌体。
4. 不建议使用 PEG 沉淀法提取的外泌体，推荐超速离心法、亲和色谱法、SEC 分子排阻 色谱法或磁珠捕获等方法提取外泌体。
5. 为达到较好的修饰效果，外泌体浓度不得低于 5×1010颗粒数/mL。
6. 为达到较好的修饰效果，生物素化的蛋白、多肽、小分子、核酸浓度不低于 4µmol/L。
7. 本试剂盒为非无菌操作，在进行下游细胞实验或体内实验前，必须将修饰好的外泌体进行 0.22um 滤膜过滤，以达到无菌状态。
8. 本试剂盒未开封前的有效期为 6 个月，请在有效期内使用。
操作方法

一、实验前准备

1. biotin linker 冻干粉溶解
从-20℃冰箱中取出 biotin linker，室温放置 10 分钟，平衡至室温。打开封口膜，在管 中加入 40µL 二甲基亚砜（DMSO），上下吹打使其充分混匀，盖好旋紧，等候下步使 用。
2. 链霉亲和素（SA）冻干粉溶解 

从-20℃冰箱中取出链霉亲和素（SA），5000g 离心 1 分钟，随后加入 75µL PBS，上 下吹打使其充分混匀，SA 终浓度为 2mg/mL。
3. SuperEV 0.5 外泌体纯化柱室温平衡 

从冰箱中取出 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱，垂直固定，如果无合适的垂直固定装置， 可从我公司购买配套的固定组件（货号：HCS1012），室温放置至少 30 分钟，使柱子 充分平衡至室温。 

注意： 

柱子平衡至室温前，不要打开顶盖和底盖。

柱子第一次使用，上筛板与填料表面可能存在间隙，这是储存过程中填料沉降造成 的，不影响分离性能，实验前将筛板向下垂直推到填料表面即可。

二、外泌体偶联 biotin

取 600µL 外泌体至 2mL 离心管中，加入 2.4µL 反应增强液，吹打混匀，再加入 6.0µL biotin linker，吹打混匀，置于旋转混匀仪或震荡混匀器上，室温震荡孵育 1.5 小时，即得到 exo-biotin 反应物。

三、exo-biotin 的纯化

1. 柱平衡（可在外泌体偶联 biotin 时完成）
1）将收集管（烧杯或普通离心管）放置在 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱下方，打开顶盖， 用移液器吸弃上方的保存液。
2）取下底盖，分次共加入 20mL PBS 冲洗柱子。
3）冲洗过程始终保持顶部筛板湿润，避免柱体变干。冲洗完成后，盖上底盖，加入少 量 PBS 等待后续操作。
2. exo-biotin 过柱纯化（去除游离的 biotin linker 分子）
1）吸弃 SuperEV 0.5 纯化柱筛板上方的 PBS，取下柱子底盖，下方放置 5mL 离心管。
2）将 exo-biotin 反应物混匀，瞬时离心，使液体全部集中在管底。
3）在筛板上方加入全部的 exo-biotin 反应物（约 600µL），待样品全部进入筛板，出 口无液体流出时，加入 2.9mL PBS。当液体全部流出后，收集完毕。该馏分大约 3.5mL，不含外泌体，可直接丢弃。
4）继续加入 1.2mL PBS 进行洗脱，用 2mL 离心管收集馏分。待出口无液体流出时， 该馏分收集完毕。exo-biotin 集中在该馏分，可用于下步操作。
5）收集完毕后，用 20mL PBS 对柱体进行冲洗，冲洗后的柱子加入少量 PBS，盖上 底盖，等待后续操作。

四、exo-biotin 通过 SA 与 biotin-目标物质偶联和纯化

1. exo-biotin 与链霉亲和素（SA）连接
在装有 exo-biotin 纯化物的离心管中，加入 9.9µL 链霉亲和素（SA），吹打混匀，37℃ 孵育 20min，即可得到偶联 SA 的外泌体，即 exo-SA。
2. exo-SA 与 biotin-目标物质连接
选择想要连接的生物素化的蛋白、多肽、小分子或核酸，取部分样品，将浓度稀释为 4µmol/L，取 300µL 直接加入到上一步的 exo-SA 反应液中，上下颠倒混匀，37℃孵育 20min。 随后对反应物作进一步纯化，步骤如下：

3. exo-SA 与 biotin-目标物质连接反应混合物纯化
1） 使用冲洗后的 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱进行纯化，步骤同前。
2） 吸弃纯化柱筛板上方的 PBS，取下柱子底盖，下方放置 5mL 离心管。
3） 将反应混合物混匀，瞬时离心，使液体全部集中在管底。
4） 在筛板上方加入 750µL 反应混合物，待样品全部进入筛板，出口无液体流出时， 加入 2.75mL PBS。液体全部流出后，收集完毕。该馏分大约 3.5mL，不含外泌体， 可直接丢弃。
5） 继续加入 1.5mL PBS 进行洗脱，用 5mL 离心管收集馏分，待出口无液体流出时， 该馏分收集完毕，修饰了目标物质的外泌体收集在该馏分。
6） 收集完毕后，用 20mL PBS 对柱体进行冲洗。
7） 冲洗完毕后，继续将剩余的 750µL 的反应混合物加入纯化柱中，进行纯化，步骤 同 4）和 5）。
8） 收集完毕，柱子可直接丢弃。
9） 本试剂盒操作过程不是无菌操作，在做下游细胞实验或体内实验前，必须将修饰的 外泌体进行 0.22um 滤膜过滤，以保证无菌。

用途：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。