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果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)测试盒 BES-BK2243B

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)测试盒

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 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

植物叶绿体中果糖 1,6-二磷酸醛缩酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。催化果糖 1,6-二磷酸和景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反应,在各种逆境胁迫下表现不同的响应。

测定原理

果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油,340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、震荡仪、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:液体 2mL×1 瓶,4℃避光保存。

酶液提取

①总 FBA 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆后于 4℃,200g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 FBA 酶活性,取沉淀加1mL 提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定叶绿体中 FBA 酶活性。

建议测定总 FBA 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA,则按照步骤②提取粗酶液。

测定操作

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2. 取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 100μL 试剂一,20μL 试剂二,20μL 试剂三,20μL试剂四,20μL 试剂五,20μL 粗酶液,充分混匀,记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s的吸光值 A2,△A=A1-A2

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T = 321.54×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/mL)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/mg prot)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr(2)按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/g 鲜重)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 643.08×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/104 cell)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T = 643.08×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA(nmol/min/mL)= ΔA÷(ε×d)×V 反总÷V 样÷T= 643.08×ΔAV 反总:反应体系总体积,0.2mL;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g


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