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果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶测试盒 BES-BK2247B

果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶测试盒

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果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)/果糖-1,6-二磷酸酯酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

果糖-1,6 二磷酸酶又称果糖 1,6 二磷酸酯酶,催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷,在糖的异生代谢和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。 测定原理

FBP 催化 1,6 二磷酸果糖和水生成 6 磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH,340nm下测定NADPH增加速率,即可计算 FBP 活性。 

需自备的仪器和用品

分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

 试剂的组成和配制

提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 20mL 试剂四充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;

试剂二:液体 7.2μL×1 支,4℃保存;临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂4℃保存;

试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;

试剂四:液体 25mL×1 瓶, 4℃保存;

样本的前处理

①总 FBP 酶提取:建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一,冰浴匀浆后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定。

②胞浆和叶绿体 FBP 酶的分离:按照植物组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 样本,加入 1mL 提取液一),冰浴匀浆后于 4℃,200g 离心 5min,弃沉淀,取上清在 4℃,8000g 离心 10min,取上清用于测定胞浆 FBP 酶活性,取沉淀加 1mL提取液二,震荡溶解后超声破碎(冰浴,200W,破碎 3s,间歇 7s,总时间 1min),然后 4℃,8000g 离心 10min,取上清测定叶绿体中 FBP 酶活性。

建议测定总 FBP 酶活性,按照步骤①提取粗酶液,若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBP,则按照步骤②提取粗酶液。 

测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂一、二、三 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、 加样表:

2021091409164124968

2021091409165718999

将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或 96 孔板中,立即混匀,加入最后一个试剂的同时

开始计时,在 340 nm 波长下记录反应 1min 后吸光度 A1 和反应 6min 后的吸光度 A2,计算ΔA=A2-A1。

FBP 活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.5×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

FBP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:

反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。


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