红霉素-N-脱甲基酶（ERND）测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是一-组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢活化。

测定原理:

ERND催化红霉素释放甲醛，通过Nash比色测定甲醛含量，即可计算出ERND活性。

自备仪器和用品:

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水和冰。

试剂组成和配置:

试剂一:粉剂X 1瓶，4'C保存。临用前加100mL蒸馏水溶解。

试剂二:液体X1瓶，4C保存。

试剂三:粉剂X1管，4'C保存。临用前加1mL蒸馏水，充分溶解。

试剂四:粉剂X 1瓶，4C保存。临用前加0.5mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五:粉剂X1瓶，4C保存。临用前，加蒸馏水4.5mL充分溶解。

试剂六:液体X1瓶，4'C保存。

试剂七:液体X1瓶，4'C保存。

标准液:液体X1瓶，-20C保存。临用前取1.5mL EP管，加入10ul 标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L标准甲醛溶液，4C 保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4C离心30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体: 100 000g，4"C， 离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加lmL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30 min， 调节波长到412 nm， 蒸馏水调零。

2.试剂二置于37"C水浴中预热30 min。

3.对照管:取0.5mL EP管，加入10yuL粗酶液，170uL 试剂二，10yL 试剂三，10uL 蒸馏水，混匀后置于37°C水浴保温30min;立即加入35uL试剂五，混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35uL试剂六，混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新的EP管，加入100uL.上清液，100uL 试剂七，混匀后60"C水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A对照管。

4.测定管:取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170uL 试剂二，10μL 试剂三，10uL 试剂四，混匀后置于37C水浴保温30min;立即加入35μuL试剂五，混匀后置于冰浴中5min;取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min;室温8000rpm离心5min;取新EP管，加入100uL.上清液，100μL 试剂七，混匀后60°C水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A测定管。

5.标准管:取0.5mL EP管，加入100uL标准品，100uL试剂七，混匀后60"C水浴10min,

然后取出，用冷水冷却5min,于412nm测定光吸收，记为A标准管。

注意:每个样品都需要做对照管。

ERND活性计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1).按照蛋白浓度计算:

活性单位定义: 37°C 下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmo/min/mg prot) = C标准品xV标准品x (A测定管- A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (CprxV 样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+Cpr.

(2).按照样本质量计算:

活性单位定义: 37°C 下，每分钟每克样品催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管- -A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (WxV样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+W

C标准品: 0 05 mmol/I.=50ymol/L; V标准品: 100I.=1X10+I; 稀释倍数: V反总+V上清液= (50+850 +50+50+175+175)六500=2.7; Cpr: 粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)， 需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒; W:样品质量，g; V样:加入粗酶液体积，10uL=0.01mL; T: 催化反应时间(min)， 30min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

(1).按照蛋白浓度计算:

活性单位定义: 37°C 下，每分钟每毫克蛋白催化产生Inmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品xV标准品x (A测定管-A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (CprxV 样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+Cpr。

(2).按照样本质量计算:

活性单位定义: 37C 下，每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。

ERND活性(nmo/min/g鲜重) = C标准品xV标准品x (A测定管一A对照管) +A标准管x稀释倍数+ (WxV样) +T=45x (A测定管一A对照管) +A标准管+W