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细胞色素b5含量测试盒 BES-BK2265B

细胞色素b5含量测试盒

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细胞色素b5含量测试盒


注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

胞色素P450酶是- -组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素P450和细胞色素b5是P450酶系的两个血红素蛋白,其比值的变化与P450代谢活性密切相关。

测定原理:

氧化型细胞色素b5经连二亚硫酸钠还原后,在424nm处有最大吸收峰,通过测定424nm和490nm处吸光值的差异,即可计算出细胞色素b5的含量。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:粉剂x1瓶,4C保存。临用前加100mL蒸馏水,充分溶解。

试剂二:液体x1 瓶,4C保存。

试剂三:粉剂x1瓶,4'C保存;

工作液配制:临用前配制,戴一次性手套, 小心打开试剂三瓶盖,加试剂二50 mL充分溶解,4C避光可保存1周。

样品中细胞色素b5提取:

1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g 组织,加入1mL试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4C离心30min,取上清液,转入超速离心管中。

2、粗制微粒体: 100 000g,4'C 离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1mL试剂- -,盖紧后充分震荡溶解,100 000g离心30min,弃上清液。

4、待测液:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL,盖紧后充分震荡溶解,即待测液,该待测液需当天测定。

细胞色素b5含量测定操作:

1.分光光度计预热30 min.

2.工作液置于25C水浴中预热30 min。

3.空白管:取1mL玻璃比色皿,加入50μL蒸馏水,1000uL工作液,室温静置2min,424nm和490nm处吸光值,424nm 处吸光值记为A空白管1, 490nm 处吸光值记为A空白管2。△A空白管=A空白管1-A空白管2

4.测定管:取1mL玻璃比色皿,加入50 μ L待测液,1000μ L工作液,室温静置2 min,424nm和490nm处吸光值,424nm 处吸光值记为A测定管1, 490nm 处吸光值记为A测定管2。OA测定管=A测定管1-A测定管2。

注意:只需要做-一个空白管。

样品细胞色素b5含量计算公式:

(1).按照蛋白浓度计算:

细胞色素b5含量(nmol/mg prot)= (OA测定管-△A空白管)+ε+dxV反总+ (CprxV 样)= 0.123*(OA测定管-OA空白管)+Cpr

(2).按照样本质量计算:

细胞色素b5含量(nmol/g鲜重) = (OA测定管-△A空白管)+ε+dxV反总x (V样总+V样)+W= 0.0614x(OA测定管-△A空白管)+Wε:还原型细胞色素b5纳摩尔消光系数,171x103 L/nmol/cm; d:比色皿光径(cm),lcm;V反总:反应体系总体积,1.05 m L=0.00105 L; Cpr: 待测液蛋白质浓度(mg/mL), 需要另外测定; V样:加入反应体系中待测液体积,50μL=0.05mL; V样总:待测液总体积,0.5mL; W:样品质量,g


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