蔗糖磷酸化酶(SP)测试盒
注意˖↓式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定
测定意义:
SP(EC2.4.1.7)ѫ要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷键,催化葡萄糖基转移到果糖ǃ木糖ǃ半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基վ聚糖,SP 还能催化氢醌合成熊果苷,具有极强的美白效果,在化妆品工业中具有重要应用
测定原理:
SP 能够以磷酸Ѫਇ体,催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸ਈս酶催化лਈսѪ 6-磷酸葡萄糖,在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用л还原 NADP+生成 NADPH,导㠤 340nm 光吸收值增࣐DŽ测定 340nm 吸光度增࣐速率,即可䇑算 SP 活性
自备实验用品及仪器:
天平ǃվ温离心机ǃ恒温水浴锅ǃ紫外分光光度䇑/酶标仪ǃ微䟿石英比色皿/96 孔板和蒸馏水
试剂组成和配制:
提ਆ液液体 100mL×1 瓶,4℃保存
缓冲液液体 10mL×1 瓶,4℃保存
试剂一液体 5mL×1 瓶,4℃保存
试剂二液体 1.5mL×1 支,4℃保存
试剂三液体 1mL×1 支,4℃保存
试剂四粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前 1mL 蒸水溶解
试剂五粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前 1mL蒸水溶解
试剂六粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前 2mL 蒸水溶解
试剂七粉剂 1 支,-20℃避光保存,临用前 2mL 蒸水溶解
粗酶液提取:
1. 组㓷˖按照组㓷质䟿˄g˅˖提ਆ液体〟(mL)Ѫ 1˖5~10 的比例˄建议〠ਆ约 0.1g 组㓷,࣐入 1mL 提ਆ液˅进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,ਆк清ᖵ测DŽ2. 㓶菌ǃ真菌˖按照㓶胞数䟿˄104 个˅˖提ਆ液体〟˄mL˅Ѫ 500~1000˖1 的比例˄建议 500 万㓶胞࣐入 1mL 提ਆ液˅,冰浴超声波破碎㓶胞˄࣏率 300w,超声 3 。,间隔 7。,总时间 3min˅˗然后 10000g,4℃,离心 10min,ਆк清置于冰кᖵ测
测定操作表:
1ǃ 分光光度䇑/酶标仪预热 30min,调节波长㠣 340nmDŽ
2、操作表
SP 活性计算公式:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式
1. 按照蛋白浓度䇑算
酶活定义˖37℃,pH6.8 时,⇿毫克蛋白质⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽ
SP 活性˄nmol/min/mg prot˅=dA×∆ε×V ৽总÷V 样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr
2. 按照样本质䟿䇑算
酶活定义˖37℃,pH6.8 时,⇿克样本⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽ
SP 活性˄nmol/min/g 鲜重˅=dA×∆ε×V ৽总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=804×△A÷W
3. 按照㓶胞数䟿䇑算
酶活定义˖37℃,pH6.8 时,⇿ 104个㓶胞⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽ
SP 活性˄nmol/min/104 cell˅=dA×∆ε×V ৽总÷(V 样÷V 样总×㓶胞数䟿˄万个˅)÷T=804×△A÷㓶胞数䟿˄万个˅ε ˖NADPH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm˗d˖比色皿光ᖴ,1cm˗V ৽总˖৽应体系总体〟,2mL˗V 样˖৽应体系中样本体〟,0.2mL˗W˖样本质䟿,g˗Cpr˖蛋白浓度,mg/mL˗T˖৽应时间,2min
b.用 96 孔板测定的计算公式
1. 按照蛋白浓度䇑算
酶活定义˖37℃,pH6.8 时,⇿毫克蛋白质⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽ
SP 活性˄nmol/min/mg prot˅=dA×∆ε×V ৽总÷V 样÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr
3. 按照样本质䟿䇑算
酶活定义˖37℃,pH6.8 时,⇿克样本⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽSP 活性˄nmol/min/g 鲜重˅=dA×∆ε×V ৽总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=1608×△A÷W3. 按照㓶胞数䟿䇑算酶活定义˖37℃pH6.8 时,⇿ 104个㓶胞⇿分钟催化产生 1nmol NADPH Ѫ一个酶活单սDŽ
SP 活性˄nmol/min/104 cell˅=dA×∆ε×V ৽总÷(V 样÷V 样总×㓶胞数䟿˄万个˅)÷T=1608×△A÷㓶胞数䟿˄万个˅ε ˖NADPH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm˗d˖比色皿光ᖴ,0.5cm˗V ৽总˖৽应体系总体〟,2mL˗V 样˖৽应体系中样本体〟,0.2mL˗W˖样本质䟿,g˗Cpr˖蛋白浓度,mg/mL˗T˖৽应时间,2min
注意事项:
1. 粉剂-20℃保存,配制好的试剂 3 天内使用完DŽ
2. 可选用 BCA 法测定蛋白含䟿试剂盒测定蛋白含䟿