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N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)测试盒 BES-BK2814B

N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)测试盒

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 N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NAG 是溶酶体中的一种酸性水解酶,广泛存在于各种组织、体液和细胞中,以前列腺和肾近曲小管细胞内含量最高。NAG 活性变化与机体某些病理状态密切相关。

测定原理:

NAG 分解 β-N-乙酰氨基葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算 NAG 活性。

自备用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 400nm,蒸馏水调零。

2、样本测定(在 EP 管中依次加入下列试剂):

2021091510323758422

充分混匀,400nm 处测定吸光值 A,计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

NAG 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y = 0.00543x +0.0083;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值。

2、血清(浆)NAG 活力的计算

单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG 活力(nmol /min/mL)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反总]÷V 样÷T =61.39×(ΔA-0.0083)

3、细胞、细菌和组织中 NAG 活力的计算

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=61.39×(ΔA-0.0083) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG 活性(nmol/min/g 鲜重)= [(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=61.39×(ΔA-0.0083)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

NAG 活性(nmol/min /104cell) =[(ΔA-0.0083) ÷0.00543×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.123×(ΔA-0.0083)V 反总:反应体系总体积,0.5mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。


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