蔗糖磷酸化酶测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中,裂解葡萄糖苷键,催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等,合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外,SP 还能催化氢醌合成熊果苷,具有极强的美白效果,在化妆品工业中具有重要应用。
测定原理:
SP 能够以磷酸为受体,催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖,在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖,在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP+生成 NADPH,导致 340nm 光吸收值增加。测定 340nm 吸光度增加速率,即可计算 SP 活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、恒温水浴锅、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 支,-20℃避光保存,临用前加 2.5mL 蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂三:粉剂×1 支,-20℃避光保存,临用前加 5mL 蒸馏水溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
粗酶液提取:
1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清待测。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
测定操作表:
1.酶标仪预热 30min,调节波长至 340nm。
2.操作表
SP 活性计算公式:
1. 按照蛋白浓度计算
酶活定义:37℃,pH6.8 时,每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。
SP 活性(nmol/min/mg prot)=dA×V 反总÷V 样÷Cpr÷T=1608×△A÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活定义:37℃,pH6.8 时,每克样本每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。
SP 活性(nmol/min/g 鲜重)=dA×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=1608×△A÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活定义:37℃,pH6.8 时,每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 为一个酶活单位。
SP 活性(nmol/min/104 cell)=dA×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量(万个))÷T=1608×△A÷细胞数量(万个) :NADPH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:比色皿光径,0.5cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL;V 样:反应体系中样本体积,0.02mL;W:样本质量,g;Cpr:蛋白浓度,
mg/mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,2min
注意事项:
1. 可选用 BCA 法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。
2. 样本较多时,可以按照每个样本试剂一:试剂二:试剂三=120:20:40(μL)的比例配制工作液,用多少配多少,临用前立刻配制,10 分钟内使用。