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胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒 BES-BK2017B

胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒

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胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原 NADP+生成 NADPH。ICDHc 是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADPH 重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理

利用 ICDHc 催化 NADP+还原成 NADPH 反应,在 340 nm 下测定 NADPH 浓度的增加。

所需的仪器和用品:

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 50 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 支,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 支,4℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂二转移至试剂一中充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min 左右;用不完的试剂 4℃保存。

3、 在试剂三中加入 550μL 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min 左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、 在试剂四中加入 550μL 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴中预热 10min 左右;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

5、 操作表:

image

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,加样本的同时开始计时;混匀,在 340nm 波长下记录 20s 时的初始吸光度 A1 和 2min20s 时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。

注意事项

1、 若 A2-A1 大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A2-A1 小于 0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、 若 A2-A1 小于 0.005,可延长反应时间到 5min 或 10min。

ICDHc 活力单位的计算:

1、血清(浆)ICDHc 活力的计算:

单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=2143×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ICDHc 活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2143×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=2143×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min /104)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=4.285×ΔAV 反总:反应体系总体积,8×10-4L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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