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可溶性淀粉合成酶(SSS)测试盒 BES-BK2379B

可溶性淀粉合成酶(SSS)测试盒

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可溶性淀粉合成酶(SSS)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

SSS(EC 2.4.1.21)通常以游离态存在于质体基质中,催化淀粉链延长,主要负责支链淀粉的合成。

测定原理

SSS 催化 ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上,同时生成 ADP,在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为NADPH,NADPH 生成量与前一步反应中 ADP 生成量呈正比,340nm 下测定 NADPH 增加量即可计算 SSS 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:40mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 14mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 8mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 10mL 试剂一充分混匀备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂五:液体×1 支,-20℃保存;临用前加入 500μL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 500μL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

粗酶液制备

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

2021091507333077234

混匀,30℃保温 30 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴冷却,10000g 4℃离心 10min,取上清液(如果一次性测定样本较多,可以将试剂四、五和六按比例配成混合液)

2021091507335160294

混匀后立即 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。

注意:试剂二如有沉淀,加入之前要使之充分溶解混匀。

SSS 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数 =529×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS 活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T×稀释倍数 =529×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2.6×10-4

L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:

反应时间,2 min;稀释倍数:1.9;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V 样) ÷T×稀释倍数=1059×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

SSS 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T×稀释倍数 =1059×ΔA÷WV 反总:反应体系总体积,2.6×10-4

L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.075 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;

T:反应时间,2 min;稀释倍数:1.9;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。


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