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酰基转移酶(AAT)测试盒 BES-BK2428B

酰基转移酶(AAT)测试盒

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酰基转移酶(AAT)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AAT 是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理:

AAT 催化乙酰 CoA 转移乙酰基到丁醇,释放的 CoA 还原 DTNB 生成 TNB;TNB 在 412nm有吸收峰,测定 412 nm 吸光度增加速率可计算 AAT 活性。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅、无水乙醇。

试剂组成和配制:

提取液:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存。

试剂三:粉剂×1 支,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 液体:直接检测。

AAT 测定操作:

1、分光光度计预热 30min,调节波长到 412 nm,蒸馏水调零。

2、工作液的配制:临用前在试剂二瓶中加入 22.5mL 试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂三的配制:临用前加无水乙醇 1.25mL 充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存。

4、 空白管:在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 提取液和 900μL 工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入 50μL 试剂三,充分混匀,25℃静置 10min,测定 412nm 处吸光值,记为 A 空白管。

5、 测定管:在 Ep 管或 96 孔板中加入 50μL 样本和 900μL 工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入 50μL 试剂三,充分混匀,25℃静置 10min,测定 412nm 处吸光值,记为 A 测定管。△A=A 测定管- A 空白管,空白管只要做一管。

AAT 活性计算公式:

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /mg prot) = △ A ÷( ×d)×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T = 98.04×△ A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /g 鲜重) = △ A ÷( ×d)×V 反总÷(W×V 样÷V 样总) ÷T = 98.04×△ A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /104cell) = △ A ÷( ×d)×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T= 98.04×△ A÷ 细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB 定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min /mL) = △ A ÷( ×d)×V 反总÷V 样÷T =98.04×△ A :TNB 消光系数,13600L/mol/cm;V 反总:反应总体积,1mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,15 min。


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