乙酰辅酶A羧化酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

测定原理

ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰辅酶 A、ATP 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。

需自备的仪器和用品

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：20mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。

试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。

试剂七：10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。

样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。

2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入 6.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入 5mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂 应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂七加 9.5 蒸馏水，充分混匀。

5、酶促反应

37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，90℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清

6、定磷

混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 30min，冷却至室温，在 660nm 处，蒸馏水调零，记录各管吸光值 A。标准管、空白管只要做一次即可，每个测定管需要设一个对照管。

注意：若测定管吸光值大于 2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于

2，可提高检测灵敏度，计算公式中乘以相应稀释倍数。

ACC 活性计算：

1、按组织蛋白浓度计算：

定义：每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V 样×Cpr)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

2、按样本鲜重计算：

定义：每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC (μmol/h/g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T=10×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

3、 按细菌或细胞密度计算：

定义：每小时每 500 万细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。

ACC (μmol/h/104cell)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）÷(500× V 样÷V 样总)÷T=0.02×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.5mL；V 样：加入样本体积，0.05mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。