磷脂酶C（PLC）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

磷脂酶 C（EC 3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯 C3 位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存在于微生物及动植物的组织和细胞中，在细胞代谢、细胞传递、生长发育等方面具有重要作用。

测定原理

磷脂酶 C 催化水解 NPPC 产生对硝基苯酚，在 410nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 55mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。

2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。

3. 血清：直接测定。

测定操作

酶活计算公式

标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R2= 0.9991

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（△ A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克组织每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC 活性（nmol/min/g 鲜重）=（△ A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC 活性（nmol/min/104cell）=（△ A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力单位。

PLC 活性（nmol/min/mL）= （△ A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷V 样÷T = 17.45×（△A+0.0103）V 反总：反应总体积，1mL；V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min