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己糖激酶(HK)测试盒 BES-BK2453B

己糖激酶(HK)测试盒

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己糖激酶(HK)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

测定原理

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH,NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 30mL×1 瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 30mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:液体 5 mL×1 瓶,4℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;临用前加入 250μL 试剂一和 250μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的前处理

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂一、二、三、四和五 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

3、 加样表:

2021091610573527784

2021091610575032970

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,立即混匀,加样本的同时开始计时,在 340 nm波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A2-A1。

注意事项

1、为了减小操作误差,建议将试剂一、二、三、四、五按比例配成混合液,预热 10min,取 30μL 样本+8μL 试剂六+1mL 混合液,混匀后按照上述步骤检测。

2、不同匀浆组织中 HK 活力不一样,做正式试验之前请做 1-2 只预试,若 ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。

HK 活性计算

1、血清(浆)HK 活性

单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=1113×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 HK 活性

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1113×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1113×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK(nmol/min /104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=2.226×ΔAV 反总:反应体系总体积,1.038×10-3 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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