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磷酸果糖激酶(PFK)/6-磷酸果糖激酶/果糖-6-磷酸激酶测试盒 BES-BK2455B

磷酸果糖激酶(PFK)/6-磷酸果糖激酶/果糖-6-磷酸激酶测试盒

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磷酸果糖激酶(PFK)/6-磷酸果糖激酶/果糖-6-磷酸激酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

PFK(EC 2.7.1.11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和ATP 转化为果糖-1,6 二磷酸和 ADP,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

测定原理

PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-1,6-二磷酸和 ADP,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PFK 活性。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存,临用前加入 2.8mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1 支,4℃保存,临用前加入 260μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;

试剂四:液体 16μL×1 支,4℃保存,临用前加入 260μL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;

样本的前处理

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 1000~5000:1 的比例(建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤和加样表

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、工作液(可测 25 个样)的配制:取 19mL 试剂一和 1.26mL 试剂二充分混匀;用不完的试剂分装后-20 度保存,禁止反复冻融;

3、将工作液置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

4、加样表:

2021091611014535083

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,立即混匀,加试剂四的同时开始计时,记录在340 nm 波长下 20 秒时的初始吸光度 A1 和 10 分 20 秒时的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2。

注意:不同匀浆组织中 PFK 活力不一样,做正式试验之前请做 1-2 只预试,若 ΔA>0.5,则说明活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至 2min 或 5min,使 ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。

PFK 活力单位的计算

1、血清(浆)PFK 活力的计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/mL)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷V 样÷T=450×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 PFK 活力计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFK(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=450×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=450×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol果糖-1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFK(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总(ε×d)×109]÷(2000×V 样÷V 样总)÷T=0.225×ΔAV 反总:反应体系总体积,8.4×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;2000:细菌或细胞总数,2000 万。


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