外泌体（Exosomes）提取试剂盒-超纯-细胞培养上清4ml/T

产品简介：

总外泌体（Exosomes）提取试剂盒（细胞培养上清用，超纯）适用于从各种原代或传代培养细胞培养上清样品中提取高纯度总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。

 外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性小囊泡，直径约为 30-150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome 内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA 和 microRNA，并且 exosome 能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。外泌体囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识，显现了外泌体作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外，未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。

 传统的体外培养的细胞中分离和提取 exosome 的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要 30-70 个小时，每次最多只能处理 6 个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。

 自主开发的外泌体快速提取试剂盒系列产品，可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA 分析、电镜分析、NTA 粒径分析等下游实验应用。

 本试剂盒按每个样本处理 4ml 细胞培养上清计，每个 50T 试剂盒大约可以用于提取 200ml细胞培养上清。如果需要处理大量的细胞培养上清，将提取液按细胞培养上清体积的 1：4加入细胞培养上清即可。

产品应用：

外泌体研究

产品特点：

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；

2.纯度高，富集量大，应用范围广；

3.获取的 Exosome 结构和功能完整；

4.稳定性好，便于运输，便于保存。

使用方法：

1.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。

2.以下以 4ml 培养基为例，实际操作时按培养基和提取液 A 用量体积比 4：1 使用即可。

3.不同细胞分泌的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。

4.一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于 8ml。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为 15-20ml 及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。

5.条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。

6.在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过 5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。

7.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或 4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

外泌体提取：

1. 收集 4ml 待提取的培养基样品，置 2-8℃保存。

2. 将样品在 4℃条件下，3000g 离心 15 分钟。弃沉淀，收集上清。

3. 小心将上清移入另一干净离心管中。

4. 将样品在 4℃条件下，10000g 离心 20 分钟。弃沉淀，收集上清。

5. 小心将上清移入另一干净离心管中。

6. 在 4ml 上清中加入 1ml 提取液 A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀 1 分钟左右，使液体充分混匀。

7. 置 2-8℃冰箱静置过夜。

8. 在 4℃条件下，10000g 离心 60 分钟。

9. 小心移除上清，收集沉淀。

10. 取 500ul 外泌体保存液将沉淀重悬，用移液器轻轻吹打混匀，得到外泌体沉淀重悬液，进行下列外泌体纯

化步骤操作。

清洗外泌体纯化离心管：

1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 

2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

外泌体纯化：

1. 将外泌体纯化离心管内管插入所提供的一个微量离心管中。

2. 向内管中加入过 500 ul 的外泌体沉淀重悬液样本，并盖上盖子。

3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，让盖子的连接带朝着转子的中央；用一个类似的离心管平衡。

4. 以 5000-8000 ×g 离心约 10-15 分钟。离心至大约剩余 50ul-100ul 液体。

5. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。

6. 为了回收纯化后的外泌体，将内管倒过来插在另一个干净的微量离心管中。放在离心机中，让打开的盖子朝着转子的中央；用一个类似的离心管进行平衡。

7. 以 1000 x g 离心 2 分钟，使纯化后的外泌体样本从纯化内管转移到收集管中。

8. 吸取收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。

9. 用纯水或缓冲液洗涤内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管清洗和保存：

1. 使用后用水冲洗干净；

2. 内管加入超纯水 500µl，5000g 离心 5 分钟；

3. 吸净内管中的水，加入 500µl 0.1M NaOH，5000g 离心 20 分钟；

4. 用 0.1M NaOH 浸泡 24 小时；

5. 用水冲洗干净；

6. 用无菌水浸泡 2-8℃保存。

7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

常见问题分析：

1.培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？

多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下 3 种方法：（1）选择商品化的无外泌体血清进行细胞培养；（2）选择无血清培养基进行细胞培养；（3）将细胞培养用的血清通过 100000g 超速离心10 小时以上以去除血清外泌体。

2.无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？

细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为 60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养 24-48h，细胞融合度达到 80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

3.准备做细胞外泌体 siRNA 的 NGS 测序，初始样品量需要准备多少？

普通肿瘤细胞系建议使用 40mL 以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备 40mL 以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

4.如何鉴定提取的外泌体？

通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白 Western blot 检测等方法鉴定提取的外泌体。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。