外泌体（Exosomes）提取试剂盒-快速超纯-血清/血浆2ml/T

产品简介：

总外泌体（Exosomes）提取试剂盒（血清/血浆用）适用于从各种血清/血浆样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。

 外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体 )的膜性小囊泡，直径约为 30-150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome 内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA 和 microRNA，并且 exosome 能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。

 外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。外泌体囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识，显现了外泌体作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外，未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。

 传统的血清/血浆中分离和提取 exosome 的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要 30-70 个小时，每次最多只能处理 6 个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。

 自主开发的外泌体快速提取试剂盒系列产品，可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA 分析等下游应用实验。

 本试剂盒按每个样本处理 2ml 血清/血浆计，每个 50T 试剂盒大约可以用于提取 100ml 血清/血浆。如果需要处理大量的血清/血浆，将提取液按说明书标准操作的体积等比例调整即可。

 可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、藻类、液体、土壤等各种不同样本的蛋白提取试剂盒。

产品应用：

外泌体研究

产品特点：

1.使用方便，无需超速离心，省时省力；

2.纯度高，富集量大，应用范围广；

3.获取的 Exosome 结构和功能完整；

4.稳定性好，便于运输，便于保存。

使用方法：

1.以下以 2 ml 血清/血浆为例，实际操作时按血清样本和提取液用量体积比等比例调整使用即可。

2.不同血清/血浆样本外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择血清/血浆样本的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。

3.常规的血清/血浆样本最佳上样量为 3-5 ml 及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的血清/血浆样本。

4.已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或 4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

清洗外泌体纯化离心管 D（大）：

1. 用缓冲液或纯水进行预清洗。 

2. 离心管中的过滤膜一旦润湿后应避免变干。如果在预清洗后不是立即使用，则让液体保留在滤膜上，直到使用。

外泌体提取：

1. 收集 2 ml 待提取的血清/血浆样品，置 2-8℃保存。

2. 将样品在 4℃条件下，3000×g 离心 15 分钟。弃沉淀，收集上清。

3. 小心将上清移入另一干净离心管中。

4. 将样品在 4℃条件下，10000×g 离心 20 分钟。弃沉淀，收集上清。

5. 小心将上清移入另一干净离心管中。

6. 在 2 ml 血清/血浆样品中加入 2 ml 提取液 A，盖紧离心管盖。

7. 轻轻上下颠倒混匀 1 分钟左右，使液体充分混匀。制备成 4 ml 待提取外泌体悬液（I）。然后进行下列外泌体纯化步骤操作。

外泌体纯化：

1. 将外泌体纯化离心管 D（大）内管插入所提供的一个配套离心管中。

2. 向内管中加入过 4 ml 的待提取外泌体悬液（I）样本，并盖上盖子。

3. 将盖好盖子的外泌体纯化离心管放入离心转子中，用一个类似的离心管平衡。

4. 以 4000×g 离心约 10-15 分钟。离心至大约剩余 50 μl-100 μl 液体。

5. 在 50-100 μl 残余液体中加入 2 ml 外泌体提取液 B。

6. 以 4000×g 离心约 10-15 分钟。离心至大约剩余 50 μl-100 μl 液体。

7. 离心结束后将整个离心管从离心机中取出，取出内管。

8. 为了回收纯化后的外泌体，用 200 μl 移液器插入纯化管的底部，吸出纯化后的 50 μl -100 μl 纯化外泌体悬液（II）。

9. 套上外泌体纯化离心管 E（小）的液体收集管，将纯化外泌体悬液（II）吸入外泌体纯化离心管 E（小）的离心管（内管）中，在 4℃，11000-13000×g 条件下离心 10-15 分钟。

10. 吸取外泌体纯化离心管 E（小）的收集管中的液体，即得到外泌体样品纯品。

11. 用纯水或缓冲液洗涤两种大小的内管和收集管，继续纯化下一个样品。

外泌体纯化离心管（大）清洗和保存：

1. 使用后用水冲洗干净；

2. 内管加入超纯水 4 ml，4000×g 离心 5 分钟；

3. 吸净内管中的水，加入 4 ml 0.1 M NaOH，4000×g 离心 20 分钟；

4. 用 0.1 M NaOH 浸泡 24 小时；

5. 用水冲洗干净；

6. 用无菌水浸泡 2-8℃保存。

7. 外管用自来水洗净后，用超纯水冲洗干净，晾干。

常见问题分析：

1.采用血浆（plasma）还是血清(serum)来源的外泌体？

对于大多数涉及到 Exosome RNA 分离的研究，我们推荐使用血浆（plasma）。因为血清收集后在凝血过程中，血小板受到刺激会产生许多 Exosome 和其他形式的小泡，因此血清中获得的小泡始终比血浆中多，甚至超过 50%的小泡来源于血小板。所以血浆是研究病理生理状态下 Exosome 更好的介质。多数的 criculating Exosome 研究样本使用的是血浆。负压采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血带，最初的几毫升不要，因为有压力激活效应，并且被成纤维细胞污染。血液收集应该轻柔并且迅速。颠倒混匀采血管 8-10 次，与管壁上的抗凝剂混合，但不要为了抗凝而剧烈摇动。离心前管子应该垂直存放，并记录实验室中存放的时间，因为从采血到离心除去细胞和血小板这中间的过程很重要，建议在 30 min 内完成，长时间的存放，而没有及时处理会导致血小板细胞 Exosome 的进一步释放。血液要尽快处理，在室温条件下分离血浆（或者血清）。所有样品要使用相同的转速和转子类型离心。

2.怎样选择抗凝剂？

抗凝剂有一个或多个形式的功能,包括螯合钙、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。一般选用EDTA 抗凝。其它有许多抗凝血剂可用，但不建议使用肝素（heparin）抗凝剂。无论是外源性或内源性起源（例如肥大细胞），肝素会抑制下游 PCR 反应，因为肝素会与引物和酶竞争与核酸结合。另外,肝素可抑制 Exosome 与靶细胞的结合,抑制 Exosome 激活血小板或降低血小板激活阈值。应用肝素治疗的病人也应该注意。 对于珍贵样本，可能需要从肝素化的血液样品中提取 RNA。核酸的检测需要通过调整 PCR 的敏感性。另外如果 Exosome 相关核酸被发现只存在于 Exosome 内,在 RNA 分离之前的洗涤也可以帮助去除肝素。其它抗凝剂如EDTA、氟化钠/草酸钾(NaF/KOx),或柠檬酸三钠[加入/不加右旋糖 dextrose(ACD)或茶碱(theophylline)、腺苷(adenosine)和双嘧达莫(CTAD)]就更复杂了，最好根据下游的试验来指导。CTAD 阻碍血小板活化和随后的 Exosome 释放。EDTA 可干扰 PCR 反应(尽管程度低于肝素),但它的存在可能是无害的。另外,下游实验的选择需要考虑到抗凝剂的使用种类。不同的聚合酶对抑制剂有不同的敏感性。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。