柠檬酸（CA）含量测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

CA是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA是三羧酸循环第一一步 反应的产物。

测定原理:

酸性条件下，柠檬酸还原Crt生成Cr+，在545nm处有特征吸收峰;通过测定545nm吸光值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体x1瓶，4°C 保存。

试剂二:液体x1瓶，4C保存。

试剂三:液体x1支，- 20"C保存。

试剂四:粉剂x1瓶，室温保存。临用前配制，加入5mL试剂一，充分溶解。

试剂五:液体x1瓶，4'C避光保存。

标准品:液体x1 支，250umol/L 柠檬酸标准液，4'C保存。

样品处理:

1. 液体样品:取0.1mL液体加试剂一0.9mL, 充分混匀，1000g， 4C离心10min， 取上清液待测。

2.组织: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: 5~10 的比例( 建议称取约0.1g组织，加入lmL试剂一)进行冰浴匀浆。11000g， 4C离心10min，取上清置冰上待测。

3.线粒体: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1: 5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入lmL试剂一)进行冰浴匀浆，600g/min， 4C离心5min;取. 上清至另一EP 管中，11000g，4'C离心10min，弃上清(此上清液可用于细胞质CA含量测定);向沉淀中加.试剂二200ul， 以及试剂三2pl，充分悬浮溶解，11000g， 4C离心10min，取. 上清液待测。

4. 细菌、真菌中:按照细胞数量(10*个): 试剂- -体积(mL)为500~1000: 1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7

秒，总时间3min); 11000g， 4'C离心10min,取上清置冰上待测。

测定操作:

1.分光光度计预热30 min，调节波长到545 nm,蒸馏水调零。

2.试剂一置于30°C水浴中预热30min。

3.空白管:取EP管，依次加入100pL蒸馏水，700uL试剂一，100uL试剂四，100uL试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A空白管。

4.标准管:取EP管，依次加入100pL标准液，700μL 试剂-一， 100uL 试剂四，100μL 试剂五，混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A标准管。

5. 测定管:取EP管，依次加入100pL. 上清液，700uL试剂一，100uL试剂四，100uL试剂五，充分混匀后室温静置30min，于545nm测定吸光度，记为A测定管。

注意:空白管和标准管只需测定-一次。

计算公式:

1.按液体样品的体积计算

柠檬酸含量(nmol/L) = [C标准液x(A测定管一A空白管)+(A标准管一A空白管)]x样品稀释倍数xV总= 2500*(A测定管一A空白管)+(A标准管一A空白管)

C标准液: 250umol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数: (0.1 mL样品+0.9mL试剂一) +0.1 mL样品=10; V总: lmL。 .

2.按组织质量计算

柠檬酸含量(nmol/g 鲜重) = [C 标准液x(A测定管- -A空白管)+(A标准管-A空白管)]xV .总+W= 250x(A测定管- -A空白管)+(A标准管一A空白管)+W

C标准液: 250μmol/L; V总:.上清液总体积， 1.0mL=0.001L; W:样品质量，g。

3.按蛋白含 量计算

柠檬酸含量(nmolmg prot)= [C标准液x(A测定管- - -A空白管)+(A标准管- A空白管)]+Cpr= 250*(A测定管- - A空白管)+(A标准管. - -A空白管)+Cpr

C标准液: 250 μ mol/L=0.25μ mol/mL; Cpr:. 上清液蛋白质 含量，mg/mL。

4.按细胞数量计算

柠檬酸含量(nmol/10* cell) = [C标准液*(A测定管- -A空白管)+(A标准管一A空白管)]xV总+细胞数量= 250*(A测定管一A空白管) +(A标准管一A空白管) +细胞数量

C标准液: 250μ mol/L; V总:上清液总体积， 1.0 mL=0.001 L; 

注意事项:

1.样品处理等过程均需要在冰上进行。