乳酸含量(LA)测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物,与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关,乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。
测定原理
乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸,同时使NAD+还原生成 NADH 和 H+,H+传递给 PMS生成的 PMSH2还原 INT 生成红色物质,在 530nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
提取液:液体 55mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 12mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 支,-20℃避光保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解。
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加 15mL 蒸馏水充分溶解。
试剂五:粉剂×1 支,4℃避光保存。
标准品:液体 1mL×1 支,4℃保存。
显色液:临用前根据用量按照提取液(V):试剂三(V):试剂四(V):试剂五(m)=1(mL):0.3(mL):3(mL):15(mg)的比例充分混匀。(注意:现配现用,用多少配多少,在棕色瓶中配制,试剂盒中带有 5 个棕色空瓶)
样本处理
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,12000g 离心 10min,取上清测定。
2. 细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);于 4℃,12000g 离心 10min,取上清测定。
3. 血清:直接测定。
测定操作
注意:标准对照管和标准测定管只需测定一次,每个样品测定管设一个样品对照管
计算公式
1. 按照蛋白含量计算
LA 含量(μmol/mg prot)=△A 样÷△A 标×C 标÷ Cpr =2×△A 样÷△A 标÷ Cpr
2. 按照样本质量计算
LA 含量(μmol/g 鲜重)=△A 样÷△A 标×C 标÷ W =2×△A 样÷△A 标÷ W
3. 按照细胞数量计算
LA 含量(μmol/104cell)=△A 样÷△A 标×C 标÷ 细胞数量 =2×△A 样÷△A 标÷ 细胞数量4. 按照液体体积计算LA 含量(μmol/mL)=△A 样÷△A 标×C 标
=2×△A 样÷△A 标C 标:标准品浓度,2mmol/L ;W:样本质量,g/mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL
注意事项
1. 若吸光值超过 2,请进行适当的稀释后再进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。
2. 最低检出限为 1.8μmol/L。