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甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒 BES-BK2498B

甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒

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甲基柠檬酸合酶(MCS)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中,与柠檬酸合酶(CS)共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理:

MCS 催化丙酰 CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅酶 A,进一步水解产生甲基柠檬酸;该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB,在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 10mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1mL×1 支,-20℃保存;

试剂四:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×2 支,4℃保存,临用前加入 800μL 无水乙醇;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂六:粉剂×4 支,-20℃保存,临用前加入 400μL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂七:粉剂×2 支,-20℃保存,临用前加入 800μL 蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 CS(此步可选做)。

⑤ 在步骤④中的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 CS 测定。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 412nm,蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

3、样本测定

2021091610295660022

2021091610301235137

将上述试剂按顺序加入 1 mL 玻璃比色皿中,加试剂七的同时开始计时,在 412nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和反应 2min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

MCS 活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=222.2×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.4444×ΔAV 反总:反应体系总体积,9×10-4L;ε:TNB 摩尔消光系数,1.36×104L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.03 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

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