线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。

测定原理：

复合体Ⅴ水解 ATP 产生 ADP 和 Pi，通过测定 Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：80mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：2 mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂五：8mL×1 瓶，4℃保存；

试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 4mL 蒸馏水，充分混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂七：粉剂×1 瓶, 4℃保存；临用前加入 10mL 蒸馏水，充分混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂八：粉剂×1 瓶, 4℃保存；临用前加入 10mL 蒸馏水，充分混匀；溶解后 4℃保存一周；

试剂九：液体 10mL×1 瓶，室温保存。

定磷试剂的配制：按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅴ（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 800uL 试剂二和 8uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅴ酶活性测定。

测定步骤：

1、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）

混匀，4000g，25℃离心 10min，取上清液

2、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）

混匀，室温静置 10min 后，在 660nm 处读取 A 测定管和 A 对照管，计算 ΔA=A 测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。

复合体Ⅴ活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为 y = 1.274x + 0.004；x 为标准品浓度（mmol/L），y 为 A 值。

1、组织中复合体Ⅴ活性的计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T =62.8× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=50.7× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /104cell）=[(ΔA-0.004) ÷1.274×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.101× (ΔA-0.004)V 反总：反应体系总体积，1.2×10-4

L； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，

g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.637x + 0.004；x 为标准品浓度（mmol/L），y 为 A 值。

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA-0.004) ÷0.637×V 反总×106]÷(V 样×Cpr) ÷T =125.6× (ΔA-0.004) ÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /g 鲜重）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反总×106]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T =101.5× (ΔA-0.004) ÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

复合体Ⅴ活性（nmol/min /104cell）=[(ΔA-0.004)÷0.637×V 反总×106]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T =0.203× (ΔA-0.004)V 反总：反应体系总体积，1.2×10-4

L； V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，0.808 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，

g；500：细胞或细菌总数，500 万。