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转氢酶-1试剂盒 BES-BK2503B

转氢酶-1试剂盒

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转氢酶-1试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH 位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化 NADH+NADP+和NAD++NADPH 相互转化。催化正向反应称为 TH-1。线粒体 NADH 含量增加时会导致线粒体膜的 H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上 ROS 的产生。TH-1 促进 NADH 转换为 NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。

测定原理

NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收,因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP+)替代 NADP+,TH-1 催化 APADP+还原生成的 APADPH 在 375nm 有特征光吸收,因此通过测定 375nm 光吸收增加速率,来计算 TH-1 活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 18mL×1 瓶,4℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

① 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 TH-1(此步可选做)。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 500uL 试剂二,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 TH-1 活性测定。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 375nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配制:临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

TH-1 活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=74.5×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.149×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:APADPH 摩尔消光系数,6.7×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=149×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADPH 定义为一个酶活性单位。

TH-1 活性(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:APADPH 摩尔消光系数,6.7×103L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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