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Na+k+ ——ATP酶测试盒 BES-BK2508B

Na+k+ ——ATP酶测试盒

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 Na+k+ ——ATP酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

Na+K+- ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。

测定原理:

Na+K+-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷,通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL ×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 6mL 蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

试剂三:液体 2mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水, 4℃保存。

试剂五:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。

试剂六:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。

试剂七:液体 25mL×1 瓶,室温保存。

试剂八:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂八 20 倍稀释,即取 0.1mL 试剂八加 1.9mL 蒸馏水充分混匀。

定磷剂的配制:按 H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

操作步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)

2021091610545162732

混匀,8000g,25℃离心 10min,取上清液

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)

2021091610550848677

混匀,室温放置 30min,在 660nm 处,记录各管吸光值。

注意:

1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒 100 管保证测 48 份 Na+K+-ATP 酶。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。

3、空白管和标准管只要做一管。

计算1、血清(浆)Na+K+- ATPase 活力的计算:定义:每小时每毫升血清(浆)中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h/mL)=[C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A空白管)÷V 样÷T=7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

2、组织、细菌或细胞中 Na+K+- ATPase 活力的计算:

(1)按蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白中 Na+K+- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /mg prot)=[C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(Cpr×V 样)÷T =7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

定义:每小时每克组织中Na+K+-ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[ C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(W× V 样÷V 样总)÷T=7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

定义:每小时每 1 万个细菌或细胞中 Na+K+-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。

Na+K+-ATP 酶活力(μmol/h /104cell) =[ C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.015×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)C 标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积,0.25mL;V 样:加入样本体积,0.1mL ;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6 小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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