线粒体呼吸链复合体Ⅱ/琥珀酸-辅酶Q还原酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶 Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基 FAD 还原为 FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶 Q 生成还原型辅酶 Q，是呼吸电子传递链的支路。

测定原理

复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶 Q 可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通过检测 2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一：25mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：5mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：0.5 mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂六：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做）。

5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅱ酶活性测定。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、100μL 试剂六和 800μL 工作液，立即混匀，记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

复合体Ⅱ活力单位的计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=559×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体 Ⅱ活力 (nmol/min/g 鲜 重 )=[ΔA×V 反总÷ （ ε×d ）×109]÷(W× V 样 ÷V 样总 )T=113×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅱ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.226×ΔAV 反总：反应体系总体积，9.4×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。