线粒体分离和线粒体酶提取试剂盒
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
线粒体是半自主性细胞器,不仅是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所,为细胞的活动提供能量,而且在许多生命活动中具有重要调控作用。因此,准确和全面分离保持正常活性的线粒体已经成为许多研究的前提。
原理
利用专门试剂温和匀浆组织和细胞,再采用差速离心法从匀浆中分离完整线粒体;利用专门试剂,配合超声波破碎线粒体,可以得到保持活性的线粒体酶。
需自备的仪器和用品
超声波破碎仪、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:50mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:10mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:10mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:1mL×1 支,-20℃保存;
提取步骤
1、 准确称取约 0.1g 组织或收集约 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂四,用冰浴匀浆器或研钵研磨。
2、 4 ℃ 600 g 离心 5min。
3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,4 ℃ 11000 g 离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物,可用于研究线粒体蛋白向胞浆的释放。
5、 沉淀为完整线粒体。含有完整的内膜和外膜,并具有线粒体的生理功能。可用于线粒体的生理功能等方面的研究。
6、 在沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂四,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),可用于线粒体酶活性测定。
7、 在沉淀中加入 200uL 试剂三和 2uL 试剂四,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),可用于线粒体蛋白浓度测定。
注意事项
1、 分离线粒体和提取线粒体蛋白质的所有步骤均需在冰上或 4℃进行,所用溶液需冰浴或4℃预冷。
2、 通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取 600g 和 11,000g,如果希望纯度更高,但对线粒体的得率要求不高,前后两次离心速度可以采用 1000g 和 3500g。
3、 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。