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乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒 BES-BK2523B

乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒

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乙酰胆碱酯酶(AchE)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AchE 属于丝氨酸水解酶,广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰胆碱(Ach)水解,在神经传导调节中起重要作用。

测定原理:

AchE 催化 Ach 水解生成胆碱,胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB);TNB 在 412nm 处有吸收峰,通过测定 412 nm 吸光度增加速率,计算 AchE活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 2.6mL 试剂一,充分震荡溶解。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 2.6mL 试剂一,充分震荡溶解。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,8000g 4℃离心 10min,取上清液待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 412 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3. 取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 上清液、800 μL 试剂一、50μL 试剂二和 50 μL 试剂三,迅速混匀,于 412nm 处测定 3min 内吸光值变化,第 10s 吸光值记为 A1,第 190s 吸光值记为 A2。△A 测定管=A2-A1。

注意:空白管只需测定一次。

AchE 活性计算公式:

1. 组织 AchE 活性

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷(Cpr ×V 样)÷T= 245×△A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷(W ×V 样÷V 样总)÷T= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞 AchE 活性活性单位定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/104cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 245×△A÷细胞数量

3. 血清 AchE 活性

活性单位定义:每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷V 样÷T=245×△Aε:TNB 摩尔消光系数,13.6×103L/mol/cm;V 反总:反应体系总体积(L),1 mL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);W:样本质量,g;V 样:加入上清液体积(mL),0.1 mL;T:反应时间(min),3 min。


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