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碱性磷酸酶(AKP/ALP)测试盒 BES-BK2525B

碱性磷酸酶(AKP/ALP)测试盒

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碱性磷酸酶(AKP/ALP)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AKP/ALP 是一种含锌的糖蛋白酶,在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中,以肝脏为主。

测定原理:

在碱性环境中,AKP/ALP 催化磷酸苯二钠生成游离酚;酚与 4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物,在 510nm 有特征光吸收;通过测定 510 nm 吸光度增加速率,来计算AKP 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体×1 瓶,4℃避光保存。

试剂三:液体×1 瓶,4℃避光保存。

试剂四:液体×1 瓶,4℃避光保存,未变成蓝绿色之前均可使用。

标准品:液体×1 支(EP 管中),2 μ mol/mL 酚标准液,4℃保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,4℃、8000g 离心 10min,取上清液待测。

2. 细菌或细胞:按照细菌或细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血液可直接测定,或者适当稀释后测定。

测定步骤:

1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 510 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂三置于 37℃水浴中预热 30 min。

3. 空白管:取 EP 管,加入 20μL 蒸馏水,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃水浴中保温 15min;加入试剂四 600μL,混匀后于 510 nm 测定吸光度,记为 A 空白管。

4. 标准管:取 EP 管,加入 20μL 标准品,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃水浴中保温 15min;加入试剂四 600μL,混匀后于 510 nm 测定吸光度,记为 A 标准管。

5.对照管:取 EP 管,加入 20μL 上清液,200μL 蒸馏水,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃水浴中保温 15min;加入试剂四 600μL,混匀后于 510 nm 测定吸光度,记为 A 测定管。

6. 测定管:取 EP 管,加入 20μL 上清液,200μL 试剂二,200μL 试剂三,混匀后置于 37℃水浴中保温 15min;加入试剂四 600μL,混匀后于 510 nm 测定吸光度,记为 A 测定管。

注意:空白管和标准管只需测定一次。每个测定管设一个对照管。

AKP/ALP 活性计算:

1. 血液中 AKP/ALP 活力计算

活性单位定义:37℃中每毫升血液每分钟催化产生 1μmol 酚定义为 1 个酶活单位。

AKP/ALP 活力(μmol/min /mL)= [C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总] ÷V 样÷T=6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

2. 组织、细菌或细胞中 AKP/ALP 活性计算

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生 1 μ mol 酚定义为 1 个酶活单位。

AKP/ALP(μmol/min/mg prot)=[C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T=6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:37℃中每克组织每分钟催化产生 1 μ mol 酚定义为 1 个酶活单位。

AKP/ALP(μmol/min/g 鲜重)=[C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W

(3)按照细菌或细胞数量计算

活性单位定义:37℃中每 104个细菌或细胞每分钟催化产生 1 μ mol 酚定义为 1 个酶活单位。

AKP/ALP (μmol/min/104cell)= [C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×V 反总]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 6.8×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数量C 标准品:2μmol/mL;V 反总:反应体系总体积(mL),1020μL=1.02 mL; V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),0.020mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间(min),15 min。

注意事项:

1.试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。

2.试剂四变蓝绿色后不能再使用。

3.加入试剂四后必须立即混匀,否则显色不完全。


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