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吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)测试盒 BES-BK2541B

吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)测试盒

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吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

吡咯啉-5-羧酸还原酶( P5CRs) 是普遍存在于原核和真核生物中的一类重要的管家蛋白。其主要功能是催化脯氨酸生物合成的最后一步反应,将吡咯啉-5-羧酸( P5C) 转化为脯氨酸,在调节细胞凋亡等一系列病理和生理过程中起着重要作用。

测定原理:

P5CR 具有噻唑烷-4-羧酸脱氢酶活性,催化噻唑烷-4-羧酸的脱氢反应,同时将 NAD 转化为NADH,测定 340nm 下吸光值增加速率来反映酶的活性。

需自备的仪器和用品:

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm。

2、 样本测定

(1)在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀,现配现用;

(2)在 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm 处 10s 时的吸光值 A1 和 2min10s 时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

P5CR 活性计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=3215×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。


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