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脯氨酸(PRO)含量测试盒 BES-BK2547B

脯氨酸(PRO)含量测试盒

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脯氨酸(PRO)含量测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

Pro 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,逆境条件下,植物体内 Pro 含量显著增加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此,脯氨酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

测定原理:

用磺基水杨酸(SA)提取 Pro,加热处理后,Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色;加甲苯萃取后,在 520nm 测定吸光度。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、冰乙酸 50mL、甲苯 50mL、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:冰乙酸 25 mL×1 瓶, 4℃保存。(自备)

试剂二:液体 25 mL×1 瓶, 4℃保存。

试剂三:甲苯 50mL×1 瓶,4℃保存。(自备)

样品测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);之后

置 90℃振荡提取 10min;10000g,25℃离心 10min,取上清,冷却后待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆;之后置 90℃振荡提取 10min;10000g,25℃离心 10min,取上清,冷却后待测。

2、血清(浆)样品:按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取 0.1mL 血清(浆)加入 1mL 提取液),充分混匀,之后置 90℃振荡提取 10 分钟,10000g,25℃离心 10 分钟,取上清,冷却后待测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 520nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定:

(1)取 0.5mL 样本+0.5mL 试剂一+0.5mL 试剂二 于有盖试管中,置沸水浴中保温 30min(盖紧,防止水分散失),每 10min 振荡一次。

(2)待冷却后,在试管中加入 1mL 试剂三,振荡 30s,静置片刻,使色素转至试剂三中;吸取 0.8mL-1mL 上层溶液于 1mL 玻璃比色皿中,于 520nm 波长处比色,记录吸光值 A。

Pro 含量计算:

1、典型回归方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 为脯氨酸含量,μg/mL;y 为吸光值 A)

2、按照血清(浆)体积计算

Pro 含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2)=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro 含量(µg/g 鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

Pro 含量(μg/104cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)V1:加入反应体系中样本体积,0.5mL;V2:加入提取液体积,1 mL;V3:加入血清(浆)体积,0.1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

注意:最低检测限为 1μg/mL 或 1μg/g 鲜重或 0.01μg/mg prot


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