谷氨酰胺合成酶（GS)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

GS（EC 6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。

测定原理

GS 在 ATP 和 Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为 γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下形成的络合物在 540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

所需的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：12mL×1 瓶，-20℃保存，临用前 37℃预热 20min，充分混匀，如有沉淀，静置 10min，取上清待用。

试剂二：12mL×1 瓶，-20℃保存，临用前 37℃预热 20min，充分混匀，如有沉淀，静置 10min，取上清待用。

试剂三：粉剂×2 瓶， -20℃保存。用时每瓶加入 5mL 蒸馏水充分溶解待用。

试剂四：15mL×1 瓶，4℃保存。

样本测定的准备

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、 在 EP 管中加入下列试剂：

混匀，25℃室温静置 10min 后，5000g，25℃离心 10min，取上清液测定 540nm 处的吸光值A。△A=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

GS 活力单位的计算

标准曲线：y = 0.8348x + 0.0008，R2 = 0.9999

1、血清（浆）GS 活性

单位定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

计算公式：

GS（μmol/h/mL）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷V 样÷T=10.268×(ΔA-0.0008)

2、组织、细菌或细胞 GS 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/mg prot）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=10.268×(ΔA-0.0008)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/g 鲜重）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=10.268×(ΔA-0.0008)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每小时产生 1μmol γ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

GS（μmol/h/104 cell）=(ΔA-0.0008)÷0.8348×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.021×(ΔA-0.0008)V 反总：反应体系总体积，0.75mL； V 样：加入样本体积，0.175mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。