单胺氧化酶测试盒
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎动物的各种器官,特别是分泌腺、脑、肝脏,在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢,含量较低,具有重要的生理功能,其活性能反映肝纤维化的程度。此外,MAO 活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转出现紊乱,从而引发多种病症。
测定原理:
MAO 催化单胺类底物脱氨生成相应的醛,进一步氧化成酸;底物在 360nm 处有特征吸收峰,测定 360nm 光吸收下降的速率,计算 MAO 活性。
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制:
提取液一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
提取液二:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 120mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 2.5mL×1 管,4℃避光保存。
粗酶液提取:
1. 称取约 0.1g 样品,加 1 mL 预冷的提取液一充分冰浴匀浆,1000g,4℃,离心 10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心 30min,弃上清;加入1mL 预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心 40min,弃上清;沉淀加入预冷的 1mL 试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定)。
2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,弃沉淀;把上清转移到另一预冷的离心管,10000g,4℃,离心 30min,弃上清;加入 1.0 mL 预冷的提取液二,震荡混匀,16000g,4℃,离心 40min,弃上清;沉淀加入预冷的 1.0 mL 试剂一,震荡混匀,即粗酶液(可用于可溶性蛋白浓度测定),取上清置于冰上待测。
3. 血清:直接测定。
测定步骤:
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 360nm。
2、操作表
注意:空白管只需测定一次。
MAO 活性计算公式:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、按蛋白含量计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每毫克蛋白质 1min 内转化 1 nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / mg prot)=dA×∆ε ×V 反总÷(V 样× Cpr)÷T= 114×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:酶活定义:37℃,pH7.6 时,每克样品 1min 内转化 1 nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / g 鲜重)= dA×∆ε ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T = 114×ΔA÷ W
3、按照细胞数量计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每 104 个细胞 1min 内转化 1 nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / 104 cell)=dA×∆
ε ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 114×ΔA÷细胞数量
4、按照液体体积计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每 mL 血清 1min 内转化 1 nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min /mL)= dA×∆ε ×V 反总÷V 样=114×ΔAε:底物摩尔消光系数,1460L /mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应总体积,0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g
b.用 96 孔板测定的计算公式如下
1、按蛋白含量计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每毫克蛋白质 1min 内转化 1 nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / mg prot)=dA×∆ε ×V 反总÷(V 样× Cpr)÷T= 228×ΔA÷Cpr
2、按样本质量计算:
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每克样品 1min 内转化 1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / g 鲜重)= dA×∆ε ×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T = 228×ΔA÷ W
3、按照细胞数量计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每 104 个细胞 1min 内转化 1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min / 104 cell)=dA×∆ε ×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)÷T= 228×ΔA÷细胞数量
4、 按照液体体积计算
酶活定义:37℃,pH7.6 时,每 mL 血清 1min 内转化 1nmol 底物的酶量为一个酶活单位。
MAO 活性(nmol/min /mL)= dA×∆ε ×V 反总÷V 样=228×ΔAε:底物摩尔消光系数,1460L /mol /cm; d:96 孔板光径,0.5cm;V 反总:反应总体积,
0.2mL;V 样:反应中样本体积,0.02mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;T:反应时间,60min,W:样本质量,g
注意事项:
1、吸光度变化应该控制在 0.01~0.8 之间。否则加大样品量或稀释样品,注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变。
2、样品蛋白质含量需要另外测定。