抗坏血酸氧化酶（AAO）活性测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAO 是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和 AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素 b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。 

测定原理：

AAO 可直接氧化 AsA，通过测定 AsA 的氧化量，可计算得 AAO 活力。 

实验中所需仪器及设备：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

 试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2mL 蒸馏水充分溶解。 粗酶液提取：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

AAO 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 上清液、170μL 预热的试剂二和 10μL 试剂三，迅速混匀后在 265nm 测定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2，△A =A1-A2。

AAO 活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 92.4×△A÷Wε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；

T：催化反应时间（min），2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T=184.8×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 184.8×△A÷Wε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；

T：催化反应时间（min），2min。

注意事项:

配制好的试剂放在 4℃保存，三天内使用完。