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单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒 BES-BK2719B

单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒

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 单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA,在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

 测定原理:

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+,NADH 在 340 nm 有特征吸收峰,但是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率,来计算出 MDHAR 活性。

实验中所需仪器及设备:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和双蒸水

试剂组成和配置:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 20mL×1 瓶,室温保存。

试剂三:粉剂×1 瓶(棕色),4℃保存。临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂五:液体 15μL×1 瓶,4℃保存。临用前加 3 mL 试剂二充分溶解。

 粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. . 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);8000g ,4℃离心 20min,取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体:直接测定。

 MDHAR 测定操作:

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 试剂三、20μL 试剂四、20μL 试剂五和 120μL试剂二,最后加入 20μL 上清液,迅速混匀后于 340nm 比色,记录 30s 和 150s 的吸光值 30s和 150s 的吸光值 A1 和 A2,△A=A1-A2。 

MDHAR 活性计算公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T= 804×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 804×△A ÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每 10

4个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 804×△A ÷ 细胞数量

(4)按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T= 804×△Aε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 1608×△A ÷W

(3)按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 1608×△A ÷ 细胞数量

(4)按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义:25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样)÷T=1608×△Aε:NADH 摩尔消光系数,6220 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 反总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4L;V 样:加入反应体系中上清液体积,20μL=0.02mL;V 样总:提取液体积,1 mL;Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定,建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒;W :样品质量;T:反应时间,2min。

注意事项:

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存,3 天内使用完。


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