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抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒 BES-BK2725B

抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒

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抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA,是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量,APX 与 AsA 具有一定的负相关性。

测定原理:

APX 催化催化 H2O2 氧化 AsA,通过测定 AsA 氧化速率,来计算得 APX 活性。

自备仪器用品:

低温离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 90mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 5 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂三:液体 5mL×1 支,4℃保存。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

测定:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 290nm,用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃中预热 30min。

3. 依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、700μL 预热的试剂一、100μL 试剂二和100μL 试剂三,迅速混匀后在 290nm 测定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2,△A=A1-A2。

APX 活性计算公式:

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T=1786×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:每 g 组织每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d)×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1786×△A ÷Wε:AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm;d:比色皿光径(cm),1 cm;V 反总:反应体系总体积(L),1000μL=1×10-3 L;109:1mol=1×109nmol;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),100μL=0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;W:样本

质量,g;T:催化反应时间(min),2min。

注意事项:

配制好的试剂二 4℃保存,并且 3 天内使用完。


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