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硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒 BES-BK2738B

硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒

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硫氧还蛋白氧化还原酶(TrxR)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

TrxR 是一种 NADPH 依赖的包含 FAD 结构域的二聚体硒酶,属于吡啶核苷酸-二硫化物氧化还原酶家族成员,与硫氧还蛋白以及 NADPH 共同构成了硫氧还蛋白系统。TrxR 与 GR 活性类似,催化 GSSG 还原生成 GSH,是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。

测定原理:

TrxR 催化 NADPH 还原 DTNB 生成 TNB 和 NADP+,TNB 在 412 nm 有特征吸收峰,通过测定 412nm 波长处 TNB 的增加速率,即可计算 TrxR 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 90mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 5 mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

TrxR 测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 412nm,用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)预热 30min。

3. 测定管:取 1mL 玻璃比色皿,加入 100μL 试剂二,100μL 试剂三,700μL 试剂一,100μL上清液,迅速混匀后于 412 nm 测定 10 s 和 310 s 吸光度,记为 A1 和 A2。△A 测定管=A2-A1。

TrxR 活性计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR(nmol/min /mg prot)=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 147×△A 测定管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR(nmol/min /g 鲜重)=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 147×△A 测定管÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR(nmol/min/104 cell)=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 147×△A 测定管÷ 细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1nmol DTNB 还原为 1 个酶活单位。

TrxR(nmol/min /mL)=△A 测定管÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 147×△A 测定管ε:TNB 在 412nm 处的微摩尔消光系数,0.0136 L/μ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积(L),1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),100μL=0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间(min),5 min。

注意事项:

1. 测定前须先取 1~2 个样做预实验,哺乳动物组织及血液制品 TrxR 活力测定时,一般须用蒸馏水稀释 5 倍左右;测定过程操作须迅速。

2. 试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。


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