γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL 基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL 活性高低对 GSH 含量和 GSH/GSSG比值有重要影响。

测定原理：

在 ATP 和 Mg2+存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出 GCL 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 70mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 14mL 蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入蒸馏水 3.5 mL 充分震荡溶解。

试剂四：液体 16mL×1 瓶，室温保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 30mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入 1.0 mL浓硫酸（自备），边加边搅拌。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

GCL 测定操作

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 660 nm，蒸馏水调零。

2. 测定管：取 1.5mLEp 管，依次加入试剂一 240 µL、试剂二 260µL、试剂三 60µL 和上清液 120µL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应 15 min； 再加入试剂四 300µL，混匀后，25℃、8000g，离心 10 min，取上清 500µL，加入试剂五 500µL，混匀后盖紧，45℃水浴 10min，冷却后测定 660 nm 处吸光值，记为 A 测定管。

GCL 活性计算公式：

标准曲线：y=0.1427x，R2=0.9987

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL（μg/min /mg prot）=[A 测定管÷0.1427×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T=3.815×A 测定管÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为 1 个酶活单位。

GCL（μg/min /g 鲜重）= [A 测定管÷0.1427×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 3.815×A 测定管÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃下，每 104个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL（μg/min /104 cell）=[A 测定管÷ 0.1427×V 反总]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 3.815×A 测定管÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL（μg/min /mL）= [A 测定管÷ 0.1427×V 反总]÷V 样÷T= 3.815×A 测定管0.1427：回归方程系数；V 反总：反应总体积（mL）980µL=0.980mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，120µL =0.12 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间：15min。

注意事项

（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。

（2）所有试剂配制完后，除表明 4℃保存外，请于 1 天内用完。

（3）实验过程请带手套，试剂三中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。

（4）测定吸光值时请于水浴后 10～40 分钟内测完。

（5）样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值太高，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释 3～5 倍。

（6）试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。

（7）细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GCL 的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；