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γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)测试盒 BES-BK2739B

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)测试盒

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γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GCL 是 GSH 合成的限速酶,GSH 对 GCL 有反馈抑制作用。GCL 基因表达受多种因素调节,如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL 活性高低对 GSH 含量和 GSH/GSSG比值有重要影响。

测定原理:

在 ATP 和 Mg2+存在下,GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸;同时 ATP 去磷酸化产生无机磷分子,通过测定无机磷增加速率,即可计算出 GCL 活性。

自备仪器和用品:

可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL 玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 70mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 14mL 蒸馏水充分震荡溶解。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入蒸馏水 3.5 mL 充分震荡溶解。

试剂四:液体 16mL×1 瓶,室温保存。

试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 30mL 蒸馏水,充分震荡溶解后,缓缓加入 1.0 mL浓硫酸(自备),边加边搅拌。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

GCL 测定操作

1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 660 nm,蒸馏水调零。

2. 测定管:取 1.5mLEp 管,依次加入试剂一 240 µL、试剂二 260µL、试剂三 60µL 和上清液 120µL,混匀后盖紧,37℃水浴准确反应 15 min; 再加入试剂四 300µL,混匀后,25℃、8000g,离心 10 min,取上清 500µL,加入试剂五 500µL,混匀后盖紧,45℃水浴 10min,冷却后测定 660 nm 处吸光值,记为 A 测定管。

GCL 活性计算公式:

标准曲线:y=0.1427x,R2=0.9987

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃下,每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL(μg/min /mg prot)=[A 测定管÷0.1427×V 反总]÷(Cpr×V 样)÷T=3.815×A 测定管÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃下,每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为 1 个酶活单位。

GCL(μg/min /g 鲜重)= [A 测定管÷0.1427×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 3.815×A 测定管÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:37℃下,每 104个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL(μg/min /104 cell)=[A 测定管÷ 0.1427×V 反总]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T= 3.815×A 测定管÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

活性单位定义:37℃下,每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为 1 个酶活单位。

GCL(μg/min /mL)= [A 测定管÷ 0.1427×V 反总]÷V 样÷T= 3.815×A 测定管0.1427:回归方程系数;V 反总:反应总体积(mL)980µL=0.980mL;Cpr:上清液蛋白质浓度,mg/mL;V 样:加入反应体系中上清液体积,120µL =0.12 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;T:反应时间:15min。

注意事项

(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,以免影响其活力。如果是匀浆液,避免反复冻融。

(2)所有试剂配制完后,除表明 4℃保存外,请于 1 天内用完。

(3)实验过程请带手套,试剂三中有强腐蚀性物质,注意不要溅到皮肤上或眼睛内。

(4)测定吸光值时请于水浴后 10~40 分钟内测完。

(5)样本测定前先取 1-2 个样做预实验,如吸光值太高,应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数,使得吸光值在标准曲线范围内,哺乳动物组织和血液一般稀释 3~5 倍。

(6)试剂三配制过程中,可能会产生黑色固体,其不影响结果,注意吸取时不要将黑色固体吸入。

(7)细胞中 GCL 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GCL 的提取时可加试剂一(或生理盐水)后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞;


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